蔣佳芮，許力，李銳，張建鐸，向海英，高茜，宋春滿，鄧樂樂，楊文武，楊光宇，張承明，李雪梅，曾婉俐

1 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南省昆明市紅錦路181號 650231；

2 云南省紅河州煙草公司建水分公司，云南省紅河哈尼族彝族自治州建水縣臨安鎮(zhèn)鐘靈路3號 654300

基因編輯技術(shù)不僅是解析闡明基因功能的重要工具，在植物育種上更為劃時(shí)代的重大突破。新興的人工改造核酸酶可以大幅提高同源重組的效率，實(shí)現(xiàn)基因組的精確、定向改造，包括歸巢核酸酶、鋅指核酸酶和TALEN 核酸酶都已在植物基因工程中得到廣泛、成功的應(yīng)用，而基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)則更具有高效方便等特點(diǎn)[1]。CRISPR/Cas（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein，串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列）是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的一種基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9 是目前應(yīng)用最多的，只需核酸酶Cas9和成熟的crRNA: tracrRNA（CRISPR-derived RNA: trans-activating RNA）復(fù)合體就可對特定外源DNA序列進(jìn)行剪切，該技術(shù)已在擬南芥、煙草、水稻等多種植物中成功編輯，證明了該技術(shù)的可行性，并實(shí)現(xiàn)了植物抗逆境、延緩果實(shí)成熟、增加殺草劑耐受性、抗病等效果[2]。

在煙草中類胡蘿卜素是最重要的萜烯類化合物之一，不僅直接影響煙葉的外觀質(zhì)量，而且還直接和間接地影響煙葉的內(nèi)在品質(zhì)，其相關(guān)降解產(chǎn)物與煙葉的香氣質(zhì)和香氣量也有密切的相關(guān)性[3]。八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）是類胡蘿卜素合成過程中的關(guān)鍵酶之一[4]。無色的八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化成有色類胡蘿卜素的過程中，PDS 發(fā)揮重要的催化作用，該酶表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致八氫番茄紅素的積累，從而影響植物的花、葉、果中類胡蘿卜素的合成，因此不同植物中PDS 的酶活性差異導(dǎo)致不同物種中類胡蘿卜素含量的差別[5-7]。已有大量的研究表明，PDS 基因與白化相關(guān)[8-10]。

單倍體是指體細(xì)胞中含有本物種配子染色體數(shù)目的個(gè)體，即凡由本物種正常個(gè)體的配子發(fā)育而來的個(gè)體，無論其體細(xì)胞中含有幾個(gè)染色體組均叫單倍體，比如，普通小麥為六倍體，體細(xì)胞含六個(gè)染色體組，其花粉培育出的單倍體植株的體細(xì)胞中就含三個(gè)染色體組[11]。1922 年Guha 首次在曼陀羅（Datura stramonium L.）中發(fā)現(xiàn)天然單倍體[12]，1964 年Guha和Maheshwari 對曼陀羅花粉進(jìn)行培養(yǎng)首次在離體條件下獲得單倍體植株[13]。體外獲取單倍體主要是通過對植物配子體細(xì)胞(雄配子體和雌配子體)進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)其從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑，進(jìn)而形成單倍體胚胎。花藥培養(yǎng)是常見的獲得父本單倍體的方法，隨著單倍體技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，單倍體已成為重要的遺傳材料和研究對象。單倍體材料作為轉(zhuǎn)化受體有以下3 點(diǎn)優(yōu)勢：（1）單倍體材料不會受到同源染色體聯(lián)會配對的影響，轉(zhuǎn)化效率可能會較高，外源基因在后代基因組中的穩(wěn)定性也會較好；（2）導(dǎo)入的外源基因不會受到等位基因之間的相互干擾；（3）經(jīng)轉(zhuǎn)化后獲得的植株不存在顯隱性問題，加倍后即可獲得純合轉(zhuǎn)化植株[14]。對單倍體基因組進(jìn)行加倍，可在一個(gè)世代內(nèi)獲得遺傳上100%純合的雙單倍體品系，從而大大加快植物品種選育進(jìn)程。最近，已有研究在玉米、小麥中聯(lián)合單倍體育種與基因編輯兩種技術(shù)，可以在兩代內(nèi)產(chǎn)生具有所需性狀改良的純合DH（Doubled haploid，雙單倍體）系，從而可繞開常規(guī)育種中復(fù)雜的雜交和回交的冗長程序[15-16]。本研究旨在為煙草基因編輯育種和基因功能研究提供了一種技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試材料

普通煙草（Nicotiana tabacum）品種紅花大金元花藥，采自石林印象煙莊大田種植的紅花大金元煙株。

1.1.2 菌株與載體

LBA4404 根癌農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells，TaKaRa）。

質(zhì)粒骨架，pORE-Cas9 骨架載體，攜帶卡那霉素抗性，獲贈(zèng)于西南大學(xué)夏慶友教授。

1.1.3 抗生素、激素和培養(yǎng)基

卡那霉素（100 mg/mL）、羧芐霉素（250 mg/mL）、NAA 母液（0.5 mg/mL）、6-BA 母液（1 mg/mL）、MS 培養(yǎng)基。

1.2 單倍體煙草材料的PDS 基因編輯方法

1.2.1 花藥單倍體培育

煙草花藥的預(yù)處理：采摘盛花期、無病植株上花冠與花萼等長的花蕾[17]，裝入牛皮紙袋中放冰盒保鮮。在實(shí)驗(yàn)室將花藥等分為8 份，1 份為新鮮花藥作對照，其他7 份放置于4℃冰箱分別預(yù)處理1～7 d。

煙草花藥離體培養(yǎng)：花蕾用75%酒精對其進(jìn)行表面消毒，然后用無菌水清洗3～4 次。剝離萼片和花冠，將花藥接種到活性炭培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度為25±1℃，光照強(qiáng)度30～50 μmol/(m2·s)，光照時(shí)間為16 h/d，培養(yǎng)45 d。花粉粒分化形成愈傷組織后長出幼苗，用剪刀或者手術(shù)刀進(jìn)行分離，然后將其置于含有活性炭MS 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，以上述相同條件下培養(yǎng)30 d 進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。

煙草幼苗倍性鑒定：利用葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法鑒定單倍體。根據(jù)大量關(guān)于煙草單倍體鑒定的研究結(jié)果顯示[18-21]，取第5 片真葉觀察下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)，葉綠體數(shù)分界臨界指標(biāo)為葉綠體數(shù)少于14～15 的為單倍體，多于14～15 而少于24～26 的為紅花大金元對照植株（異源四倍體，后文統(tǒng)稱為四倍體），鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)98.5%。

1.2.2 PDS 質(zhì)粒載體構(gòu)建

PDS sgRNA 序 列：GCTGCATGGAAAGATGAT GATGG[22]。

將靶序列上下游引物（上游引物：GATTGGCT GCATGGAAAGATGATGA；下游引物：AAACTCAT CATCTTTCCATGCAGCC）雙鏈退火并與預(yù)先用BsaI 酶切過的pORE-Cas9 骨架載體連接。連接體系：酶切載體100 ng，退火產(chǎn)物2 μL，T4 連接酶1 μL，T4 Buffer 1 μL，ddH2O 補(bǔ) 齊 至10 μL，16 ℃連接30 min。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培 養(yǎng)12～16 h。 用U26-JCF：5'-TTAGGTTT ACCCGCCAATA-3'和靶序列下游引物對菌斑進(jìn)行陽性克隆的PCR 擴(kuò)增、克隆和測序篩選。從測序正確的菌中提取純化質(zhì)粒，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

構(gòu)建的PDS 基因編輯質(zhì)粒載體如圖1 所示。

圖1 PDS 基因編輯質(zhì)粒圖譜Fig. 1 PDS plasmid profile of gene editing system.

1.2.3 單倍體基因編輯的遺傳轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌菌液制備：按照購買的LBA4404 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞提供的說明步驟，將帶有編輯PDS 基因片段的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化LBA4404 農(nóng)桿菌，進(jìn)行相應(yīng)的培養(yǎng)，最后利用MS 液體培養(yǎng)基懸浮菌體至OD 600 = 0.6～0.8。

煙草葉盤遺傳轉(zhuǎn)化：將確定為單倍體的植株，利用手術(shù)刀對葉片進(jìn)行切取，獲得約1×1 cm2的葉盤。同時(shí)，切取同葉齡的紅花大金元四倍體無菌苗葉盤作為對照。將單倍體和對照的葉盤分別浸入到上述懸浮菌液中10 min，取出葉盤在滅菌濾紙上吸干菌液，置于MS 共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：28℃，黑暗培養(yǎng)3 d。3 d 后將葉盤轉(zhuǎn)至MS 分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，直至形成分化芽，每7～10 d 更換一次分化培養(yǎng)培養(yǎng)基，更換5～6 次，培養(yǎng)條件為：28℃光照培養(yǎng)16 h/d，光照強(qiáng)度30～50 μmol/(m2·s)，25℃黑暗培養(yǎng)8 h/d，45～60 d。待愈傷組織上分化芽培養(yǎng)長至2～4 cm 高，切下分化芽，插入MS 生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，在上述相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7～10 d 至生根。在生根培養(yǎng)階段，觀察統(tǒng)計(jì)分化苗白化情況并記錄。

1.2.4 轉(zhuǎn)化幼苗編輯靶點(diǎn)分子檢測

隨機(jī)選擇單倍體和四倍體轉(zhuǎn)化植株中表型為白化的植株各10 株，取葉片檢測編輯靶點(diǎn)，測序公司為諾禾致源生物技術(shù)公司。

2 結(jié)果

2.1 單倍體培育結(jié)果

2.1.1 單倍體幼苗培育

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對照組各100 ?；ㄋ帲罅康幕ㄋ幵谂囵B(yǎng)過程中褐化，少量花藥膨脹形成愈傷組織。45 d 培養(yǎng)后，形成愈傷組織率及獲得單倍體植株數(shù)量如表1 所示。其中，在低溫處理4～6 d 后，花藥形成愈傷組織率較新鮮花藥培養(yǎng)有顯著提高，并且從每?；ㄋ幩纬傻挠鷤M織中發(fā)出的單倍體幼苗數(shù)量也較多。大部分愈傷只能發(fā)出1～5 個(gè)幼芽，但少部分可叢生幼芽，能分離出20～40 株幼苗，這種現(xiàn)象在4℃處理4～6 d 的實(shí)驗(yàn)組中發(fā)生較多。圖2 A-C 所示為花藥到單倍體幼苗的培育過程；圖2 C-D 為單倍體和四倍體的幼苗和葉片對比，單倍體的葉片較四倍體的葉片狹長。

2.1.2 單倍體鑒定

取第5 片真葉觀察下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)，葉綠體數(shù)分界以15 和26 為臨界指標(biāo)，葉綠體數(shù)少于15 的為單倍體，多于15 而少于26 的為四倍體。碘液染色后鑒別結(jié)果如圖2 E-F 所示，分別為單倍體和四倍體第5 片真葉下表皮保衛(wèi)細(xì)胞。單倍體（圖2 E）絕大部分氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)在7～13，四倍體（圖2 F）的葉綠體數(shù)絕大部分在14～23。并且可以看出，單倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞形狀近圓，較四倍體小。

表1 低溫處理花藥形成愈傷組織及單倍體出苗數(shù)量Tab. 1 The number of callus and haploid by low-temperature treatment of anthers

圖2 單倍體培育過程及下表皮保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)鑒定倍性Fig. 2 The process of haploid culture and the chloroplast number of guard cells in lower epidermis for ploidy identification

2.2 單倍體PDS 基因編輯遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果

轉(zhuǎn)化單倍體葉盤268 枚，紅花大金元四倍體對照葉盤167 枚。遺傳轉(zhuǎn)化及組織培養(yǎng)后，獲得單倍體T0代植株120 株，其中86 株為白化植株，占T0代植株的71.67%；紅花大金元四倍體T0代植株51 株，其中24 株白化植株（5 株為嵌合體，即葉片部分白色，占白化植株20.83%），占T0代植株的47.06%。獲得的T0代植株中，單倍體出現(xiàn)白化苗的概率（71.67%）較紅花大金元出現(xiàn)白化苗的概率（47.06%）高。

表2 單倍體PDS 基因編輯遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果Tab. 2 The results of genetic transformation of haploid PDS gene editing

2.3 轉(zhuǎn)化幼苗編輯靶點(diǎn)分子檢測結(jié)果

煙草為異源四倍體植物，在其單倍體細(xì)胞中存在兩套染色體組，故基因編輯過程中可能只有一條染色體上的基因位點(diǎn)被編輯，也可能兩條染色體上的基因位點(diǎn)均被編輯。在T0代白化植株（不包括嵌合體）中，隨機(jī)選取單倍體和紅花大金元各10 株進(jìn)行sgRNA 分子檢測。10 株單倍體T0代白化植株中，2 個(gè)植株為編輯位點(diǎn)雜合（即峰圖為編輯位點(diǎn)及之后雙峰），8 個(gè)植株為編輯位點(diǎn)純合（即峰圖為編輯位點(diǎn)及之后單峰），存在插入和缺失突變，如圖3 C 所示；10 株紅花大金元T0 代白化植株中，6 個(gè)植株為編輯位點(diǎn)雜合，4 個(gè)植株為編輯位點(diǎn)純合，存在缺失突變，如圖4 C 所示。

3 討論

圖3 單倍體轉(zhuǎn)化植株及分子檢測結(jié)果Fig. 3 The transformation of plant and molecular detection results of haploid

圖4 紅花大金元轉(zhuǎn)化植株及分子檢測結(jié)果Fig. 4 The transformation of plant and molecular detection results of Honghuadajinyuan

在本研究中，煙草單倍體受體材料的高效獲得，是進(jìn)行單倍體基因編輯的基礎(chǔ)。在花藥培養(yǎng)過程中，大部分花藥褐化干癟，部分膨大但不形成愈傷組織也不出芽，王茂良等[23]的研究中提出過小孢子的發(fā)育去向。有研究指出，預(yù)處理有助于細(xì)胞脫分化，可提高小孢子的離體培養(yǎng)反應(yīng)能力，煙草花藥的預(yù)處理措施主要是通過低溫誘導(dǎo)（一般0～9℃）[24]。國外有研究表明[25]，低溫預(yù)處理不僅能延緩煙草花粉的退化，還能減輕花藥藥室壁組織的衰老，使更多花粉細(xì)胞開始新一輪的繁殖增長，提高花粉的抗逆境性。陳春艷等[26]研究表明，煙草花藥在接種前的最適低溫預(yù)處理時(shí)間為48 h，可明顯提高胚狀體的萌發(fā)誘導(dǎo)率。故本研究在4℃預(yù)處理不同天數(shù)，結(jié)果顯示預(yù)處理4～6天花藥出苗率更高。但同一批培養(yǎng)的花藥，會出現(xiàn)有的花藥可以出苗幾十株，有的1～5 株，大部分不出苗的情況，這與陳學(xué)軍等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，這可能與實(shí)驗(yàn)操作、花藥供體植株的生理狀況、花藥選取時(shí)間及花藥的生理狀況等有關(guān)。

在煙草育種工作中，育種目標(biāo)是獲得具有目的性狀的純合體。單倍體的染色體數(shù)是正常體細(xì)胞染色體數(shù)的1/2，理論上在單倍體中基因位點(diǎn)被編輯成功的概率更高，且編輯成功的單倍體加倍后獲得的雙單倍體即為純合體，但煙草是異源四倍體，含四套染色體組，單倍體也含兩套染色體組，故在T0代中仍會出現(xiàn)雜合情況，需要進(jìn)一步篩選單倍體T0代中的位點(diǎn)純合編輯體。本研究利用PDS 基因在編輯后產(chǎn)生白化植株作為編輯成功的可視化標(biāo)志，故在T0代白化植株中隨機(jī)選擇各10 株進(jìn)行編輯靶點(diǎn)分子檢測，結(jié)果顯示10 株單倍體白化植株中8 株為編輯位點(diǎn)純合，10株紅花大金元（四倍體）白化植株中4 株為編輯位點(diǎn)純合，可見單倍體白化植株中編輯位點(diǎn)純合的概率較四倍體更高。并且在經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)后，獲得的T0代植株中，單倍體出現(xiàn)白化苗的概率（71.67%）也較紅花大金元出現(xiàn)白化苗的概率（47.06%）高。作為對照組的紅花大金元T0代白化植株中出現(xiàn)嵌合體，而在單倍體實(shí)驗(yàn)組中沒有出現(xiàn)嵌合體。在T0代白化植株中，位點(diǎn)純合和雜合編輯體在表型上并無明顯差異，還需輔助分子檢測等手段篩選純合編輯植株。在T0代綠色植株中，可能存在編輯但無性狀的情況（可能只編輯了一條染色體），需要分子檢測或者自交后確認(rèn)，但本實(shí)驗(yàn)旨在T0代即可篩選出編輯成功的位點(diǎn)純合編輯單倍體，故對該部分實(shí)驗(yàn)材料未進(jìn)行進(jìn)一步檢測。這顯示了單倍體作為受體材料的優(yōu)勢，單倍體細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生的任何變化都可以通過染色體加倍一次性純合[27]。傳統(tǒng)育種獲得純合穩(wěn)定品系需要連續(xù)7 代自交和選擇，且無法實(shí)現(xiàn)所有性狀的絕對純合，而雙單倍體技術(shù)只需1～2 代即可獲得遺傳上100%純合的品系[28]。以單倍體作為基因編輯受體材料，如再利用單倍體加倍技術(shù)，可使后代迅速純合并穩(wěn)定遺傳。

4 結(jié)論

本研究旨在為煙草基因編輯和基因功能研究提供了一種技術(shù)方法。（1）在花藥單倍體培育方法中，低溫處理適宜時(shí)間后，能有效提高花藥形成愈傷組織及形成單倍體幼苗的效率。（2）本研究結(jié)果顯示，單倍體作為基因編輯的受體，只含正常體細(xì)胞1/2 的染色體數(shù)，轉(zhuǎn)化后植株位點(diǎn)純合編輯概率更高?？山Y(jié)合利用加倍技術(shù)，快速獲得基因編輯純合體材料。