山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心/山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)/國家衛(wèi)生健康委生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(山東 濟(jì)南 250062)

王志宇 曹廣祥 付加芳 宗工理 李俊玲 張佩佩 王世立

骨硬化病又稱石骨癥，是一種少見的全身性骨結(jié)構(gòu)發(fā)育異常的先天性疾病，以骨密度增高、破骨細(xì)胞吸收功能障礙為主要特點(diǎn)[1]。2000年，美國FDA批準(zhǔn)重組人干擾素γ(rhIFNγ-1b，商品名 Actimmune)上市用于治療骨硬化病。資料顯示，該藥用于骨硬化病治療存在周期長、副作用大等缺點(diǎn)，究其原因與藥物的平均組織分布有關(guān)[2-4]。我們課題組擬制備能夠靶向骨組織的干擾素γ。研究表明由天冬氨酸或谷氨酸組成的寡肽能夠選擇性輸送至骨組織，并且在骨組織內(nèi)長期保留[5]。已有研究證實(shí)偶聯(lián)有上述酸性氨基酸寡肽的雌激素、左氧氟沙星、堿性磷酸酶、β-葡糖苷酸酶等藥物能夠選擇性靶向骨組織，使藥物在骨組織內(nèi)富集[6-8]?；谏鲜鏊嵝园被峁央牡墓前邢蛳到y(tǒng)，是否能夠應(yīng)用于干擾素，使IFNγ更多富集于骨組織，目前尚不清楚。

將10個天冬氨酸殘基連接于人干擾素γ羧基端，在大腸桿菌內(nèi)融合表達(dá)并純化[9]。本研究探討純化獲得的重組人干擾素γ在體外的生物學(xué)活性，包括是否具有骨靶向性以及是否能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑rhIFNγ-D10和rhIFNγ為本實(shí)驗(yàn)室制備；RANKL(PeproTech)納米羥基磷灰石(nHAP，Sigma)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)；TRAP染色試劑盒(Sigma)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(四季青)。

1.2 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7(ATCC，美國)用含有10%FBS的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時，按1:3細(xì)胞傳代。不使用胰酶消化細(xì)胞，加入5mL培養(yǎng)基直接從壁上吹下細(xì)胞，轉(zhuǎn)入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，確保細(xì)胞貼壁后融合度在25%～50%。

1.3 TRAP破骨細(xì)胞染色將RAW264.7細(xì)胞(1×105個/mL)接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為RANKL(終濃度100ng/mL)、RANKL+rhIFNγ-D10(分別為100ng/mL和30ng/mL)、RANKL+rhIFNγ(100ng/mL和30ng/mL)、rhIFNγ-D10(30ng/mL)和rhIFNγ(30ng/mL)五個組，每組3個重復(fù)孔。加藥后隔天更換含有上述細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)液，于誘導(dǎo)后的第4天，按照TRAP試劑盒使用說明對細(xì)胞進(jìn)行染色，利用倒置熒光顯微鏡(100×)觀察各組細(xì)胞TRAP染色情況。

1.4 重組人骨靶向干擾素γ(rhIFNγ-D10)的親骨性評價羥基磷灰石是骨基質(zhì)的主要成分，本研究采用羥基磷灰石吸附法[10]評價蛋白的體外親骨性。以納米羥基磷灰石作為吸附介質(zhì)，使其與待測蛋白溶液(C0)充分相互作用，除去吸附介質(zhì)后用BCA(Bicinchoninine acid assay)法測定作用后蛋白溶液的濃度(Ca)。蛋白與羥基磷灰石親和性的大小通過吸附率計(jì)算，公式為：吸附率=(C0－Ca)/C0×100%。

具體方法為：吸取濃度為50μg/mL和100μg/mL的rhIFNγ-D10和rhIFNγ蛋白溶液各5mL，分別加入nHAP 15mg，超聲分散5min后，室溫下劇烈振搖90 min。另設(shè)1×PBS溶液為空白對照組。取溶液過濾并收集所有濾液，BCA法檢測并計(jì)算濾液中未吸附的蛋白濃度值(μg/mL)，根據(jù)上述公式計(jì)算不同蛋白的吸附率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果表示為(±s)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用配對t檢驗(yàn)方法分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同種類干擾素對R A W 2 6 4.7 巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響分別用R A N K L、RANKL+rhIFNγ-D10、RANKL+rhIFNγ、rhIFNγ-D10和rhIFNγ誘導(dǎo)刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞，并于誘導(dǎo)的第4天采用TRAP細(xì)胞染色法檢測不同蛋白因子對促巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示，RANKL組在誘導(dǎo)的第4天出現(xiàn)明顯的TRAP染色陽性破骨細(xì)胞，RANKL+rhIFNγ-D10組和RANKL+rhIFNγ組誘導(dǎo)TRAP染色陽性破骨細(xì)胞明顯少于RANKL組，rhIFNγ-D10組和rhIFNγ組沒有誘導(dǎo)產(chǎn)生TRAP染色陽性破骨細(xì)胞。以上結(jié)果表明：干擾素包括骨靶向干擾素(rhIFNγ-D10)和非骨靶向干擾素(rhIFNγ)在RANKL存在的前提下，對RANKL促進(jìn)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化具有明顯的抑制作用。隨機(jī)挑選各組第4天的3個視野觀察TRAP染色陽性破骨細(xì)胞，結(jié)果如圖1。

2.2 重組人骨靶向干擾素rhIFNγ-D10的親骨性評價將50μg/mL和100μg/mL(C0)的rhIFNγ-D10、rhIFNγ溶液各5mL，于室溫劇烈振蕩條件下與超聲分散后的羥基磷灰石15mg結(jié)合90min。結(jié)合后過濾，取濾液BCA法測定溶液中未結(jié)合的各蛋白濃度(Ca)。根據(jù)公式1.4計(jì)算各蛋白吸附率。結(jié)果顯示，起始濃度為50μg/mL的rhIFNγ-D10組和rhIFNγ組吸附后濃度分別為22.71μg/mL和42.44μg/mL，根據(jù)公式計(jì)算吸附率分別為54.24%和15.13%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，如圖2。起始濃度為100μg/mL的rhIFNγ-D10組和rhIFNγ組吸附后濃度分別為46.68μg/mL和86.14μg/mL，根據(jù)公式計(jì)算吸附率分別為53.32%和13.86%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，如圖2。以上結(jié)果表明：前期制備的重組人骨靶向干擾素(rhIFNγ-D10)具有良好的骨靶向性。

圖1 rhIFNγ-D10和rhIFNγ對RAW264.7巨噬細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞的影響。

圖2 不同濃度的rhIFNγ-D10和rhIFNγ對羥基磷灰石的吸附率。

3 討 論

骨靶向藥物不僅能夠提高治療有效性，而且明顯降低毒副作用。其靶向策略主要包括兩大類，其一為靶向整個骨組織；其二為特異性地靶向骨細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等。大多數(shù)骨靶向藥物靶向骨基質(zhì)的主要成分羥基磷灰石，包括帶負(fù)電荷的氨基酸寡肽或二膦酸鹽[11]。本研究將10個天冬氨酸寡肽偶聯(lián)干擾素γ羧基末端，在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化[9]，其純化產(chǎn)物經(jīng)體外羥基磷灰石結(jié)合試驗(yàn)表征，證實(shí)具有明顯的骨靶向性。目前骨靶向藥物已用于骨關(guān)節(jié)炎(OA)、骨質(zhì)疏松以及骨代謝性發(fā)育不良等疾病的治療[11]。骨靶向性干擾素在動物體內(nèi)的骨靶向性以及用于骨硬化癥等骨疾病的治療效果有待進(jìn)一步研究。

2000年美國FDA批準(zhǔn)干擾素γ用于骨硬化癥治療，但其機(jī)理尚不闡明。干擾素是骨免疫系統(tǒng)重要的細(xì)胞因子，其中干擾素γ為II型干擾素。目前認(rèn)為干擾素-γ在促進(jìn)破骨細(xì)胞形成過程中具有雙重作用，抑制或促進(jìn)破骨細(xì)胞分化取決于局部環(huán)境中細(xì)胞因子的種類與濃度。有研究表明干擾素-γ通過誘導(dǎo)泛素依賴的TRAF6信號分子降解抑制RANK介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化[12]。干擾素-γ受體缺陷小鼠體內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)量增多并表現(xiàn)出明顯骨丟失[12]。此外，干擾素-γ在感染、炎癥、雌激素缺乏等病理?xiàng)l件下間接促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，但干擾素-γ對破骨細(xì)胞形成的直接作用鮮有研究報道[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在未加入RANKL的實(shí)驗(yàn)組，干擾素-γ對破骨細(xì)胞沒有明顯的直接抑制或促進(jìn)分化作用，但在RANKL促進(jìn)破骨分化過程中表現(xiàn)出一定的抑制作用，對破骨細(xì)胞分化的免疫調(diào)控有了新的補(bǔ)充。

綜上所述，在羧基末端偶聯(lián)10個天冬氨酸多肽的骨靶向系統(tǒng)，可有效將干擾素γ靶向至骨組織。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的干擾素γ及干擾素γ-D10(即骨靶向干擾素γ)均未顯示對巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的促進(jìn)作用。與之相反，在破骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中，兩者均顯示一定的抑制作用，其具體的分子調(diào)控機(jī)制目前鮮有報道。骨硬化癥是一種以破骨細(xì)胞骨吸收功能障礙為特征的遺傳性骨病，本研究初步研究結(jié)果表明，干擾素γ及骨靶向干擾素γ對破骨細(xì)胞分化有抑制作用，可能不適合骨硬化癥治療，此研究結(jié)果與Imel等[14]研究報道一致。此外，乳腺癌、肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中，破骨細(xì)胞骨吸收功能過度增強(qiáng)[15]，本研究發(fā)現(xiàn)干擾素γ對破骨細(xì)胞分化的抑制作用提示可將干擾素γ用于防治腫瘤骨轉(zhuǎn)移，但具體應(yīng)用有待進(jìn)一步深入研究。