孫秀青，趙紅麗

（鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鶴壁 458000）

隨著對(duì)抗生素使用的日益關(guān)注，飼料添加劑（如活性干酵母）被廣泛用于畜牧業(yè)，以提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能和免疫力（仲偉光等，2018）。具有活性的干酵母也可以通過增加反芻動(dòng)物丙酸濃度和產(chǎn)生同型乙酸的細(xì)菌數(shù)量來有效降低甲烷產(chǎn)量（許斌斌，2016）。瘤胃丙酸的生成可以作為氫氣的競(jìng)爭(zhēng)途徑，而同型乙酸細(xì)菌可以利用二氧化碳和氫氣生成乙酸，其在反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)氫回收中扮演重要角色。未消化的碳水化合物在豬大腸內(nèi)的發(fā)酵主要產(chǎn)生短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸以及氣體，如二氧化碳、氫氣和甲烷。此外，從能量效率和環(huán)境角度來看，甲烷和氫氣代表了能量的損失（Scheehle和 Kruger，2006）。雖然豬的腸內(nèi)甲烷產(chǎn)量遠(yuǎn)低于反芻動(dòng)物，但由于前者養(yǎng)殖數(shù)量龐大，有必要對(duì)減少豬的甲烷產(chǎn)量進(jìn)行調(diào)查。本研究旨在利用體外離體發(fā)酵技術(shù)，評(píng)估兩珠活酵母對(duì)豬大腸產(chǎn)甲烷的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)供體及體外培養(yǎng) 試驗(yàn)選擇兩頭平均體重為60 kg的商品豬，飼喂以玉米和豆粕為基礎(chǔ)的日糧（表1），每天飼喂2次。飼養(yǎng)4周后對(duì)豬進(jìn)行屠宰，收集大腸內(nèi)容物作為接種物，定量轉(zhuǎn)移到塑料袋中，密封，在預(yù)加熱至39℃的水浴中孵育2 h。腸道內(nèi)容物與緩沖液（碳酸氫鈉+碳酸氫銨）按1∶3的比例混合，4層紗布過濾。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分

1.2 體外培育及樣品分析 酵母的濃度為1.8×1010個(gè)/g，兩種酵母分別以0.3 mg/mL和0.6 mg/mL的濃度添加。在兩個(gè)發(fā)酵箱中分別進(jìn)行兩次24 h相同的孵育試驗(yàn)，這兩個(gè)發(fā)酵箱接受相同的處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。發(fā)酵結(jié)束后，使用氣密注射器從每個(gè)發(fā)酵箱中取出約50 mL的氣體樣本，轉(zhuǎn)移到氣體采樣袋中進(jìn)行甲烷分析。注射器的內(nèi)容物分別轉(zhuǎn)移EP管并在冰箱中保存，目的是阻止進(jìn)一步發(fā)酵。以3500×g離心10 min，取上清液于EP管中，-80℃保存，用于隨后的揮發(fā)性脂肪酸分析。孵育殘?jiān)?0 mL蒸餾水洗滌2次，60℃干燥至恒重，稱重計(jì)算體外干物質(zhì)降解率。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算與分析 計(jì)算乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比（mmol/100 mmol），即樣品中揮發(fā)性脂肪酸的測(cè)定濃度除以揮發(fā)性脂肪酸的總濃度再乘以100。根據(jù)揮發(fā)性脂肪酸濃度和甲烷量估計(jì)氫釋放和回收率（Demeryer和 Degraeve，1991）。各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均值用SAS軟件單因素方差分析模型，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，同時(shí)研究揮發(fā)性脂肪酸濃度與甲烷產(chǎn)量的相關(guān)性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 活酵母對(duì)豬大腸體外發(fā)酵干物質(zhì)降解和氣體生成的影響 由表2可知。添加酵母后，總氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量顯著下降（P＜0.05），其中面包酵母組甲烷產(chǎn)量占比顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。兩種活酵母組甲烷降低百分比分布為10.1%和26.2%。0.6%釀酒酵母和0.3%面包酵母組干物質(zhì)降解率最高（P＜0.05）。

表2 不同活酵母對(duì)豬大腸體外發(fā)酵干物質(zhì)降解和氣體生成的影響

表3 不同活酵母對(duì)豬大腸體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

2.2 活酵母對(duì)豬大腸體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響 由表3可知，補(bǔ)充0.6 mg/mL釀酒酵母和0.3 mg/mL面包酵母組丙酸、丁酸、戊酸及揮發(fā)性脂肪酸總量濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而乙酸濃度有降低趨勢(shì)（P=0.09）。0.6 mg/mL面包酵母組及0.3和0.6 mg/mL釀酒酵母組丙酸、丁酸、戊酸比例顯著升高（P＜0.05），乙酸比例顯著降低（P＜0.05）。補(bǔ)充兩種酵母顯著降低了氫的回收率（P＜0.05）。

由表4可知，甲烷產(chǎn)量和乙酸占比及乙酸與丙酸比值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而丙酸的比例與甲烷產(chǎn)量有顯著負(fù)相關(guān)趨勢(shì)（P=0.07）。

表4 甲烷生成與揮發(fā)性脂肪酸占比的相關(guān)性

3 討論

本研究選擇的兩株活酵母細(xì)胞主要是基于其增長(zhǎng)率，結(jié)果僅顯示其對(duì)豬大腸內(nèi)容物體外培養(yǎng)潛在的甲烷生成有抑制作用（表2）。這一結(jié)果與Lynch和Martin（2002）報(bào)道的結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)釀酒酵母降低了瘤胃甲烷生產(chǎn)，但Lila等（2006）用混合瘤胃菌群分批培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)對(duì)甲烷的抑制作用。這些結(jié)果之間的差異可能與菌株特征、日糧組成和劑量有關(guān)。本研究中酵母處理組的總產(chǎn)氣量顯著下降，而在Lila等（2006）的報(bào)道卻有所增加，這可能與酵母處理中乙酸產(chǎn)量的下降有關(guān)，因?yàn)槎趸己蜌錃馐翘妓衔锇l(fā)酵過程中生成乙酸的副產(chǎn)物。較低的甲烷量與氣體總量比值表明活酵母可以降低甲烷生成量，但對(duì)氣體總量的降低無顯著影響。

補(bǔ)充0.6 mg/mL釀酒酵母和0.3 mg/mL面包酵母組丙酸、丁酸、戊酸及揮發(fā)性脂肪酸總量濃度顯著高于對(duì)照組，同時(shí)0.6 mg/mL面包酵母組及0.3和0.6 mg/mL釀酒酵母組丙酸、丁酸、戊酸比例顯著升高。當(dāng)碳水化合物發(fā)酵成乙酸和丁酸時(shí)，作為甲烷合成主要底物的二氧化碳和氫氣生成，而丙酸的生成則作為有效氫氣的競(jìng)爭(zhēng)途徑（Boadi等，2004）。乙酸和丁酸產(chǎn)量與甲烷量表現(xiàn)為顯著正相關(guān)，以及丙酸比例與甲烷產(chǎn)量有顯著負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了活酵母可以通過提高丙酸產(chǎn)量來抑制甲烷生成。

Chaucheyras等（1995）體外研究表明，即使在產(chǎn)甲烷菌存在的情況下，補(bǔ)充活酵母對(duì)同型產(chǎn)乙酸菌利用氫氣和產(chǎn)乙酸有有益影響。當(dāng)甲烷產(chǎn)量降低時(shí)，氫濃度往往增加，同時(shí)同型乙酸均可以利用二氧化碳和氫氣產(chǎn)生乙酸，這在一些非反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)中發(fā)酵生成氫氣的再利用起重要作用。此外，硫化氫是在大腸中通過異化硫酸鹽還原作用產(chǎn)生的，如果提供足夠的硫酸鹽，該反應(yīng)對(duì)氫的親和力更高，氫的閾值比產(chǎn)甲烷低（Zinder，1993）。雖然我們沒有檢測(cè)大腸內(nèi)容物中的硫酸鹽濃度，但Ushida等（1995）在豬盲腸內(nèi)容物中檢測(cè)到大約10 mmol/L的游離硫酸鹽，這足以使硫酸鹽進(jìn)行還原反應(yīng)。本研究的氫回收率僅在58%～65%之間，這可能是因?yàn)椴糠謿錃獗挥糜谏a(chǎn)硫化氫。較低的氫氣回收率表明，在豬后腸中存在還原性乙酸，這是乙酸的一個(gè)重要來源。此外，在本研究中，酵母處理組的氫氣回收率顯著下降（表3），同時(shí)，酵母補(bǔ)充組乙酸產(chǎn)量增加，甲烷產(chǎn)量降低，表明活酵母誘導(dǎo)了更高的乙酸生成。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究使用的2種活酵母是潛在的腸內(nèi)甲烷生成抑制劑。與對(duì)照組相比，釀酒酵母水平越高，面包酵母水平越低，干物質(zhì)體外降解率、揮發(fā)性脂肪酸總量、丙酸產(chǎn)量越高。本研究結(jié)果表明，活酵母細(xì)胞通過改變發(fā)酵途徑，使丙酸產(chǎn)量高于乙酸和丁酸，從而降低氫氣量。