馬天祥

（中國(guó)石油大慶煉化公司研究院，黑龍江大慶163411）

大慶油田的3次采油技術(shù)在國(guó)內(nèi)處于領(lǐng)先地位，繼聚合物驅(qū)油和化學(xué)三元復(fù)合驅(qū)油后，無(wú)堿二元復(fù)合驅(qū)油和微生物驅(qū)油技術(shù)等已經(jīng)提上日程，其中生物表面活性劑驅(qū)油有重要的應(yīng)用前景。

1 脂肽類表面活性劑研究現(xiàn)狀

在石油開采領(lǐng)域，最受關(guān)注的生物表面活性劑是以表面活性素為代表的脂肽家族。1968年Arima等［1］首次發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌株（Bacillussubtilis）產(chǎn)生的是脂肽類表面活性劑。

脂肽分子由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，由于特殊的化學(xué)組成和兩親型分子結(jié)構(gòu)，使其成為具有高表面活性和穩(wěn)定性的生物表面活性劑。其提高原油采收率機(jī)理在于能夠降低表界面張力，降低毛細(xì)管力，有利于原油流動(dòng)，從而提高石油開采量［2］。典型的表面活性素分子的氨基酸序列結(jié)構(gòu)見圖1，分子結(jié)構(gòu)見圖2。

圖1表面活性素分子氨基酸序列

圖2表面活性素分子結(jié)構(gòu)式

包括疏水端的脂肪酸鏈和親水端的環(huán)狀寡肽，即由12～16個(gè)碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸與7個(gè)氨基酸形成的肽環(huán)構(gòu)成，其末端氨基酸的羧基與脂肪酸鏈的β-羥基縮合形成內(nèi)脂結(jié)構(gòu)［3，4］，其主要生產(chǎn)菌株是枯草芽孢桿菌和假單胞菌。

在成本方面，由于脂肽結(jié)構(gòu)和合成機(jī)制復(fù)雜，天然合成效率不高。野生菌脂肽產(chǎn)量約1 g/L，當(dāng)脂肽產(chǎn)量為20 g/L時(shí)，其生產(chǎn)成本就可以與目前廣泛應(yīng)用的石油磺酸鹽相當(dāng)。

如果表面活性素的用量?jī)H為石油磺酸鹽的20%～10%時(shí)，則表面活性素的使用成本將降得更低，可以從根本上解決成本問題。

2 表面活性素合成菌株的小試和中試培養(yǎng)

2.1 清華大學(xué)技術(shù)研發(fā)

清華大學(xué)化工系10多年前開始脂肽生產(chǎn)菌株改造及其發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究。通過對(duì)合成表面活性素的枯草芽孢桿菌細(xì)胞工廠的跨膜通道、強(qiáng)啟動(dòng)合成、氨基酸前體途徑、脂肪酸前體途徑以及芽孢合成途徑進(jìn)行基因調(diào)控改造，目前獲得的重組枯草芽孢桿菌的表面活性素產(chǎn)量已經(jīng)可達(dá)20 g/L以上，是公開報(bào)道的最好水平。

基于與清華大學(xué)化工系合作進(jìn)行的生物表面活性素產(chǎn)業(yè)化技術(shù)開發(fā)，首先利用清華大學(xué)前期已經(jīng)對(duì)產(chǎn)表面活性素野生菌株B.subtilis THY-7以及高產(chǎn)基因工程菌B.subtilis TS1726Y的發(fā)酵培養(yǎng)基（碳源、氮源、碳氮比、微量元素）及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化基礎(chǔ)上，通過搖瓶發(fā)酵優(yōu)化確認(rèn)了基因工程菌B.subtilis TS1726Y的優(yōu)化培養(yǎng)條件及其在優(yōu)化條件下的搖瓶產(chǎn)量，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了高壓液相色譜分析和鑒定。

進(jìn)一步在30 L發(fā)酵罐的小規(guī)模中試發(fā)酵水平上對(duì)基因工程菌B.subtilis TS1726Y的發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行了考察，確定了合適的發(fā)酵模式和攪拌轉(zhuǎn)速。

2.2 表面活性素合成菌株的搖瓶實(shí)驗(yàn)

首先在搖瓶中進(jìn)行了對(duì)誘導(dǎo)劑、氨基酸、豆油前體等培養(yǎng)基配方的優(yōu)化驗(yàn)證，確認(rèn)了高產(chǎn)表面活性素的基因工程菌B.subtilis TS1726Y的優(yōu)選培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，配方見文獻(xiàn)［5］。

采用優(yōu)化方案后進(jìn)行菌株發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵時(shí)間由60 h縮短至48 h且產(chǎn)物最高產(chǎn)量達(dá)26 g/L，與優(yōu)化前的13.6 g/L相比，表面活性素產(chǎn)量提高了近1倍。針對(duì)配方中用量最大、對(duì)表面活性素產(chǎn)量影響較大的紅糖,選擇市場(chǎng)上4個(gè)品牌進(jìn)行試驗(yàn),篩選出使用北京某品牌產(chǎn)量最高。表面活性素含量測(cè)定方面,在利用清華大學(xué)提供的液相色譜法的同時(shí)，嘗試了用酸沉法測(cè)定，結(jié)果表明2者差別不大,均可用于含量測(cè)定。

采用高壓液相色譜對(duì)產(chǎn)出的表面活性素進(jìn)行了鑒定，4種主要產(chǎn)物的脂肪酸鏈長(zhǎng)度分別為C13、C14、C14以及C15，見圖3。

基因工程菌B.subtilis TS1726Y合成的表面活性素產(chǎn)品由4種主要產(chǎn)物構(gòu)成，清華大學(xué)合作者通過串聯(lián)質(zhì)譜分析，進(jìn)一步證明這4種產(chǎn)物中的脂肪酸鏈長(zhǎng)度分別為C13、C14、C14以及C15，其7種氨基酸組成分別為Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu或Glu-Val-Leu-Leu-Asp-Leu-Val。

圖3搖瓶表面活性素液相色譜

3 發(fā)酵罐中試實(shí)驗(yàn)

3.1 不同發(fā)酵模式對(duì)比

由于脂肽類表面活性劑的特殊性質(zhì)，在搖瓶水平時(shí)較易生產(chǎn)，但放大至發(fā)酵罐水平時(shí)由于通氣和攪拌的存在極易產(chǎn)生大量泡沫，導(dǎo)致發(fā)酵過程無(wú)法順利進(jìn)行?，F(xiàn)階段脂肽發(fā)酵模式主要有外源添加消泡劑、直接排泡、泡沫回流等方式。對(duì)各方式發(fā)酵周期及OD600進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見圖4。

圖4不同發(fā)酵模式OD600變化對(duì)比

發(fā)酵過程添加消泡劑是常規(guī)發(fā)酵中抑制泡沫的有效方法，常規(guī)發(fā)酵中所用到的消泡劑主要有硅類、天然油脂、聚醚類、高碳醇和聚醚改性硅類等，但有機(jī)硅及聚醚類消泡劑在添加量過多后均會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)造成一定抑制作用，大豆油作為碳源促進(jìn)菌體生長(zhǎng)代謝并提高脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量，因此嘗試選擇大豆油作為脂肽發(fā)酵過程中所用消泡劑。實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)，豆油作為消泡劑一定程度上可以消除前期培養(yǎng)基內(nèi)蛋白質(zhì)類物質(zhì)所產(chǎn)生的泡沫，但對(duì)產(chǎn)物引起的泡沫抑制能力有限，需持續(xù)添加，至發(fā)酵中后期豆油對(duì)脂肽所產(chǎn)生的泡沫完全無(wú)抑制作用，發(fā)酵周期僅維持約28 h。由于脂肽是1種較好的乳化劑，在發(fā)酵液中添加豆油后由于攪拌及通氣作用，很容易使發(fā)酵液與豆油之間發(fā)生乳化反應(yīng)形成穩(wěn)定的水包油狀態(tài)，該狀態(tài)在發(fā)酵結(jié)束后很難消除，對(duì)后期檢測(cè)及提取造成困難。且由于乳化現(xiàn)象的存在使發(fā)酵液OD600持續(xù)增加直至結(jié)束時(shí)達(dá)到50，對(duì)觀察發(fā)酵周期內(nèi)菌體生長(zhǎng)情況造成阻礙。

脂肽發(fā)酵過程中泡沫產(chǎn)生比較劇烈，若直接將泡沫排出收集，同時(shí)會(huì)帶走大量培養(yǎng)基，導(dǎo)致罐內(nèi)發(fā)酵液損失嚴(yán)重，發(fā)酵16 h后發(fā)酵液損失約一半，在28 h時(shí)，10 L體積的培養(yǎng)基剩余量?jī)H為1 L，致使發(fā)酵無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行，同時(shí)發(fā)酵液的損失導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能被充分利用，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少也限制了產(chǎn)物的合成。且由于產(chǎn)物均聚集在排出的泡沫內(nèi)，發(fā)酵中途取樣所得發(fā)酵液內(nèi)只能檢測(cè)到少量產(chǎn)物，對(duì)發(fā)酵過程的監(jiān)控也造成影響。

對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，增加泡沫收集裝置并通過蠕動(dòng)泵將收集的泡沫及發(fā)酵液重新泵回發(fā)酵罐，能極大程度降低發(fā)酵過程中由于泡沫不斷排出引起的發(fā)酵液損失現(xiàn)象，使發(fā)酵液內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分得到充分利用的同時(shí)增加發(fā)酵周期，使產(chǎn)物合成時(shí)間增加從而達(dá)到增加產(chǎn)量的目的，因此對(duì)30 L發(fā)酵罐泡進(jìn)行了增加泡沫回流改造，流程見圖5。

圖5帶泡沫回流的發(fā)酵系統(tǒng)流程

3.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響

在固定通入空氣量前提下,通過對(duì)比不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以判斷發(fā)酵過程最佳溶氧控制條件以及在該條件下的脂肽最高產(chǎn)量。

圖6不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響

由圖6可看出，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速大于300 rpm時(shí)隨攪拌轉(zhuǎn)速增加發(fā)酵液產(chǎn)物含量總體呈下降趨勢(shì)，而當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速低于300 rpm時(shí)產(chǎn)量同樣呈下降趨勢(shì)。此種現(xiàn)象可能歸因于過高的攪拌速度會(huì)使發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)生劇烈而穩(wěn)定持久的泡沫，泡沫排出過快導(dǎo)致發(fā)酵液和菌體細(xì)胞的回流循環(huán)作用降低，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)量減少。而當(dāng)攪拌速度過低時(shí)則無(wú)法保證發(fā)酵所需溶氧條件，使菌體生長(zhǎng)及代謝緩慢，同樣使發(fā)酵產(chǎn)量降低。攪拌轉(zhuǎn)速300 rpm條件下的脂肽產(chǎn)量達(dá)到了34 g/L。

4 結(jié)論

（1）搖瓶和30 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了B.subtilis TS1726Y基因工程菌的優(yōu)化培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，表面活性素產(chǎn)量搖瓶達(dá)到26 g/L，而在30 L發(fā)酵罐達(dá)到了34 g/L，是已知文獻(xiàn)報(bào)道的最高表面活性素產(chǎn)量，成本已不再是制約工業(yè)化生產(chǎn)的障礙。

（2）目前化學(xué)合成表面活性劑被廣泛使用，在3次采油的油田產(chǎn)出液中含有大量化學(xué)表面活性劑，由于化學(xué)表面活性劑難降解，使后續(xù)污水處理難度大，外排污水達(dá)標(biāo)難；而生物表面活性劑是微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，能夠很快被生物降解，環(huán)境友好，生物相容性好。

由于生物表面活性劑具有既親水又親油的兩性分子結(jié)構(gòu)，使其與化學(xué)表面活性劑具有類似的性能。生物表面活性劑通常比合成化學(xué)表面活性劑擁有更為復(fù)雜和龐大的分子結(jié)構(gòu)，單個(gè)分子占據(jù)更大的空間，因而顯示較低的臨界膠團(tuán)濃度，它們能顯著地降低表面張力、改善界面性質(zhì)。此外，生物表面活性劑還具有選擇性好、用量少、無(wú)毒、無(wú)污染、生產(chǎn)工藝和設(shè)備簡(jiǎn)單、耗能少等特點(diǎn)。