嵇 威，李饒樺，錢時權(quán)

（淮陰師范學(xué)院，生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇省食品質(zhì)量安全與營養(yǎng)功能評價重點建設(shè)實驗室，江蘇淮安 223300）

玉米秸稈是供作飼料為主的糧、經(jīng)、飼兼用作物，同時也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要廢棄物。我國有著極其豐富的玉米秸稈資源，每年產(chǎn)量達2.65 億t 左右[1-2]，大部分被直接焚燒或還田，得不到充分的利用。玉米秸稈含有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等大分子碳水化合物，利用木聚糖酶酶解這些大分子化合物可以進一步制備功能性低聚糖[3-5]。研究表明，功能性低聚糖可替代蔗糖廣泛應(yīng)用在飲料、乳制品、調(diào)味品和糖果等食品中[6-7]。目前，國內(nèi)已有大量關(guān)于玉米秸稈資源在飼料、肥料、燃料、食用菌基料、工業(yè)原料等方面的開發(fā)利用報道[8-10]。盡管如此，利用木聚糖酶酶解玉米秸稈制備低聚糖的研究文獻很少。

目前，農(nóng)作物秸稈功能性糖的提取方法主要有熱解法和酶解法。熱解法得到的低聚木糖產(chǎn)率雖高，但高溫?zé)峤膺^程中易產(chǎn)生一些對人體有害的副產(chǎn)物。酶解法利用木聚糖酶的專一性和高效性，能有效降解秸稈中的木聚糖形成低聚糖。以玉米秸稈為原料，研究木聚糖酶解對玉米秸稈低聚糖提取的影響，并在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)曲面法對玉米秸稈低聚糖酶解提取工藝進行了優(yōu)化，旨在為玉米秸稈資源的高效開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

玉米秸稈，采集自淮安郊區(qū)農(nóng)場；木聚糖酶（100 000 U/g）、3,5 - 二硝基水楊酸試劑、氫氧化鈉、酒石酸鉀納、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、濃鹽酸、水楊酸鈉、水楊酸、無水乙醇、95%乙醇、氯化鈉、鐵氰化鉀三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵，均為分析純，以上試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16C 型高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；722G 型紫外可見分光光度計，上海光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；FA214 型電子分析天平，上海精密儀器有限公司產(chǎn)品；HH 型恒溫水浴鍋，金壇市中大儀器廠產(chǎn)品；ZWY-110H 型恒溫振蕩器，上海智誠分析儀器制造公司產(chǎn)品；KH-45A 型恒溫干燥箱，廣州康恒儀器有限公司產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 玉米秸稈低聚糖的提取

2.1.1 玉米秸稈木聚糖的提取

選取形態(tài)良好的玉米秸稈，曬干后粉碎，在60 ℃下烘制至恒質(zhì)量，過60 目篩制成粉末。準(zhǔn)確稱取5.00 g 玉米秸稈粉末于錐形瓶中，加入100 mL 蒸餾水，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的NaOH 溶液，置于90 ℃水浴鍋中蒸煮2 h，蒸煮液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心10 min，收集上清液。向上清液中加入0.5 mol/L的HCl 至pH 值為6.0，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的H2O2放置一段時間脫色處理；向脫色過后的溶液中加入3 倍體積的95%乙醇，4 ℃下醇沉12 h，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心10 min，收集沉淀，經(jīng)真空干燥后研磨，得到玉米秸稈木聚糖粉末。

2.1.2 玉米秸稈低聚糖的制備

稱取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，加入一定量的木聚糖酶，調(diào)節(jié)pH 值，放入恒溫振蕩器中加快酶解。酶解結(jié)束后，于沸水中10 min 滅酶，冷卻后以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心10 min，收集上清液，得到玉米秸稈低聚糖溶液。按2.1.1 中的方法得到玉米秸稈低聚糖粉末備用。

2.2 玉米秸稈低聚糖提取率及平均聚合度的測定

該方法參考何亮亮[11]的方法。取1 mL 玉米秸稈低聚糖溶液于試管中，加入1.5 mL DNS 試劑，搖均后于沸水浴中保溫5 min，拿出冷卻至室溫后定容至25 mL，取一定體積溶液于波長540 nm 處測定吸光度，以蒸餾水為對照液，平行測定3 次，取平均值。另取1 mL 玉米秸稈低聚糖溶液，加入1.5 mL DNS試劑和2 mol/L H2SO4溶液1 mL，于沸水浴中保溫30 min，拿出冷卻至室溫后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的NaOH 溶液中和至中性，定容至25 mL，取一定體積于波長540 nm 處測定吸光度，以蒸餾水對照，平行測定3 次，取平均值。

式中：A1——加入硫酸銅前波長540 nm 處低聚糖溶液的吸光度；

A2——加入硫酸銅后波長540 nm 處低聚糖溶液的吸光度；

M——玉米秸稈粉末的質(zhì)量，g。

式中：A1——加入硫酸銅前波長540 nm 處低聚糖溶液的吸光度；

A2——加入硫酸銅后波長540 nm 處低聚糖溶液的吸光度。

2.3 酶解法提取玉米秸稈低聚糖單因素試驗

2.3.1 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對玉米秸稈低聚糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，在保持其他條件不變時，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，1.3%，1.5%，1.7%，1.9%，2.0%的酶，按照2.1.2和2.2 方法提取低聚糖，計算低聚糖提取率，考查酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對玉米秸稈低聚糖提取率的影響，比較不同提取率下低聚糖聚合度的差異。

2.3.2 酶解時間對玉米秸稈低聚糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，加入一定量的酶，保持其他條件不變，按酶解時間為2，4，6，8，10，12 h，按照2.1.2 和2.2 方法提取低聚糖，計算低聚糖提取率，考查酶解時間對玉米秸稈低聚糖提取率的影響，比較不同提取率下低聚糖聚合度的差異。

2.3.3 pH 值對玉米秸稈低聚糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，保持其他條件不變，按照酶解時pH 值為1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0，按照2.1.2 和2.2 方法提取低聚糖，計算低聚糖提取率，考查酶解時間對玉米秸稈低聚糖提取率的影響，比較不同提取率下低聚糖聚合度的差異。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、酶解時間（B） 和pH 值（C） 3 個因素，以玉米秸稈低聚糖提取率（Y） 為響應(yīng)值，采用Box-behnken 試驗設(shè)計方法優(yōu)化玉米秸稈低聚糖提取工藝參數(shù)。

試驗因素與水平設(shè)計見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗

表1 試驗因素與水平設(shè)計

3.1.1 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對玉米秸稈低聚糖提取率和聚合度的影響

酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對低聚糖提取率和聚合度的影響見圖1。

由圖1 可知，隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，低聚糖提取率先升高后下降，最后基本不變；原因可能是反應(yīng)剛開始時，木聚糖酶迅速酶解木聚糖得到較多的低聚糖，所以隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，低聚糖含量逐漸升高，當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到一定量后，會抑制反應(yīng)的進行，從而導(dǎo)致低聚糖得率下降，最后達到新的平衡，故最后低聚糖提取率不變。從圖1 同時可以看出，低聚糖的平均聚合度隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，呈現(xiàn)出跟提取率相同的變化趨勢，可能與酶解反應(yīng)的程度有關(guān)。在酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.3%時，低聚糖提取率和平均聚合度達到最大。因此，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇1.3%為適宜。

3.1.2 酶解時間對玉米秸稈低聚糖提取率和聚合度的影響

酶解時間對低聚糖提取率和聚合度的影響見圖2。

由圖2 可知，玉米秸稈低聚糖提取率和平均聚合度隨酶濃度增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，原因可能是因為反應(yīng)時間過長，酶的活力下降和部分低聚糖發(fā)生水解造成提取率下降和聚合度下降。在酶解時間為6 h 時低聚糖提取率和平均聚合度達到最大。因此，酶解時間為6 h 較為適宜。

3.1.3 pH 值對玉米秸稈低聚糖提取率和聚合度的影響

pH 值對低聚糖提取率和聚合度的影響見圖3。

由圖3 可知，隨著pH 值的升高，低聚糖提取率和平均聚合度同步變化，均線上升后下降，原因是pH 值過高或過低都會使木聚糖酶失活，導(dǎo)致低聚糖提取率下降。低聚糖提取率在pH 值為5.0 時達到最大，此時平均聚合度也最佳，本著提高低聚糖產(chǎn)率的期望，pH 值為5.0 最合適。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化玉米秸稈低聚糖提取工藝

綜合分析單因素試驗結(jié)果，選取酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、酶解時間（B） 和pH 值（C） 為自變量，以低聚糖提取率（Y） 為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化。

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

由表2 可知，建立玉米秸稈低聚糖提取率對酶濃度、酶解時間和pH 值二次多元回歸方程為：

方差分析見表3。

表3 方差分析

對表2 和表3 比較分析，得到的模型（p＜0.000 1）顯著，而且該模型的擬合度較好，因為失擬項不顯著（p=0.748＞0.05）；R2=0.997 7，說明低聚糖提取率99.77%的變異都能通過此模型解釋。在分析的結(jié)果中，其中一次項A 和C 極其顯著（p＜0.000 1），表明酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH 值對低聚糖提取率影響極顯著。同時，交互項（AB、AC、BC） 和二次項（A2、B2、C2） 對提取率的影響也都極為顯著（p＜0.01）。由F值大小可知，影響玉米秸稈低聚糖提取率主要因素主次順序為A＞C＞B，即酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH 值＞酶解時間。

3.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，得出酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時間和pH 值對低聚糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖。

酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解時間交互作用對低聚糖提取率的影響見圖4。

由圖4 可知，當(dāng)固定條件為pH 值時，另外2 個因素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解時間逐漸升高時，玉米秸稈低聚糖的提取率，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。

酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH 值交互作用對低聚糖提取率的影響見圖5。

由圖5 可知，當(dāng)固定條件為酶解時間時，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH 值對低聚糖提取率交互作用對提取率的影響極為顯著，表現(xiàn)為隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH 值的升高先升高后下降。

酶解時間和pH 值交互作用對低聚糖提取率的影響見圖6。

由圖6 可知，當(dāng)固定條件為酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)時，低聚糖提取率隨酶解時間和pH 值的變化而變化，表現(xiàn)為隨酶解時間和pH 值的增大先上升后下降，由響應(yīng)面圖和等高線圖可知，當(dāng)?shù)途厶翘崛÷蔬_到一定值后不再增加[12]。

通過回歸模型和響應(yīng)曲面法對參數(shù)的最優(yōu)化分析，得出酶解法制取玉米秸稈低聚糖的最佳條件為酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.3%，酶解時間6.12 h，pH 值5.45，在此工藝條件下，得到低聚糖提取率的最大預(yù)測值為59.3%。考慮到實際操作情況，對最佳條件進行了適當(dāng)調(diào)整：酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.3%，酶解時間6.12 h，pH 值5.40，在此工藝條件下進行3 次重復(fù)試驗，得到玉米秸稈低聚糖的實際提取率為59.24%，平均誤差為1.13% （n=3），試驗值與理論值基本吻合。以上結(jié)果表明，所獲得的模型能有效用于玉米秸稈低聚糖提取。

4 結(jié)論

采用了酶解法提取玉米秸稈低聚糖，研究了酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時間、pH 值對玉米秸稈低聚糖提取率的影響，并考查了低聚糖的平均聚合度；采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了酶解法提取玉米秸稈低聚糖的工藝條件。結(jié)果表明，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時間和pH 值對低聚糖提取有顯著影響。得到酶解法制備玉米秸稈低聚糖的最佳工藝條件為酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.3%，酶解時間6 h，pH 值5.40，在此條件下玉米秸稈低聚糖的提取率為59.24%。