紀(jì)錢萍，李 偉，佟長(zhǎng)青

（大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023）

研究表明，全世界的高血壓患者已占世界總?cè)丝诘?/3，并且患病比例逐年增加[1]。其中，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，血管緊張素-II 能夠?qū)е卵獕旱臅簳r(shí)升高[2]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE） （EC 3.4.15.1）催化血管緊張素I 轉(zhuǎn)變成具有活性的血管緊張素II。抑制ACE 活性的物質(zhì)往往具有潛在的抑制高血壓發(fā)生的活性，因此常常利用抑制ACE 活性試驗(yàn)來(lái)篩選這類物質(zhì)。

肽類和多糖類物質(zhì)的抗高血壓作用有很多研究報(bào)道[3-5]。前期研究證明了牡蠣多糖對(duì)高血壓模型Wistar 大鼠的降血壓活性[6]。結(jié)合企業(yè)的生產(chǎn)實(shí)際，將大鯢肽與牡蠣多糖進(jìn)行組合，制備成具有協(xié)同抗高血壓活性的復(fù)合粉，為其在保健食品中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鯢活性肽，張家界（中國(guó)） 金馳大鯢生物科技有限公司提供；馬尿酰- 組氨酰- 亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE），美國(guó)Sigma 公司提供；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

牡蠣多糖按照石璇等人[6]的方法制備。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品；Hypersil BDS C18色譜柱。

1.3 ACE 活性測(cè)定

將牡蠣多糖配制成質(zhì)量濃度為8 mg/mL 的溶液，大鯢活性肽配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的溶液，然后分別按照5∶1，3∶1，1∶1，1∶3，1∶5 體積比進(jìn)行混合，制備成大鯢活性肽牡蠣多糖復(fù)合粉溶液。5∶1 復(fù)合粉溶液的牡蠣多糖質(zhì)量濃度為6.67 mg/mL，大鯢肽質(zhì)量濃度為0.33 mg/mL；3∶1 復(fù)合粉溶液的牡 蠣多糖質(zhì)量濃度為6 mg/mL，大鯢肽質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL；1∶1 復(fù)合粉溶液的牡蠣多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL，大鯢肽質(zhì)量濃度為1 mg/mL；1∶3 復(fù)合粉溶液的牡蠣多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL，大鯢肽質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL；1∶5 復(fù)合粉溶液的牡蠣多糖質(zhì)量濃度為1.33 mg/mL，大鯢肽質(zhì)量濃度為1.67 mg/mL。

使用大連依利特Hypersil BDS C18色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為228 nm，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL /min；流動(dòng)相為30 %甲醇（0.1%三氟乙酸TFA 和0.05%冰醋酸，pH 值3.0～3.3）；柱溫為25 ℃。

在離心管中加入5 μL 樣品溶液和15 μL ACE（60 mU/mL） 混勻后于37 ℃條件下水浴5 min，之后加入25 μL HHL（7.6 mmol/L） 于37 ℃條件下水浴反應(yīng)25 min，隨后加入10%三氟乙酸溶液10 μL用來(lái)終止反應(yīng)，最后加入150 μL 超純水混勻。用1 mL 的注射器將反應(yīng)液過(guò)0.22 μm 的過(guò)濾膜，于波長(zhǎng)228 nm 處使用高效液相色譜紫外檢測(cè)器對(duì)濾液進(jìn)行檢測(cè)，記錄出峰時(shí)間和面積，空白試驗(yàn)用等體積的超純水代替樣品溶液。樣品溶液對(duì)ACE 活性的抑制率計(jì)算公式是：

式中：M——空白組馬尿酸的峰面積；

N——樣品中馬尿酸的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢活性肽ACE 抑制活性

通過(guò)大鯢活性肽ACE 抑制活性測(cè)定試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大鯢活性肽具有很好的抑制ACE 活性。

大鯢活性肽ACE 抑制活性見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，在大鯢活性肽質(zhì)量濃度5 mg/mL時(shí)，對(duì)ACE 抑制率達(dá)到75.78%，ACE 抑制率隨著大鯢活性肽質(zhì)量濃度的增加而增加，具有質(zhì)量濃度依賴性。大鯢活性肽是通過(guò)大鯢肉酶解制備的分子量小于2 000 Da 的肽，具有較好的抗氧化活性[7]。張江濤等人[8]研究林蛙低聚肽的抗氧化活性與ACE 抑制作用，發(fā)現(xiàn)林蛙低聚肽具有較好的抗氧化活性和ACE 抑制作用。

2.2 牡蠣多糖ACE 抑制活性

通過(guò)牡蠣多糖的ACE 抑制活性測(cè)定試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)牡蠣多糖具有一定的抑制ACE 活性。

牡蠣多糖ACE 抑制活性見(jiàn)圖2。

由圖2 可知，在牡蠣多糖質(zhì)量濃度9 mg/mL 時(shí)，對(duì)ACE 抑制率為33.40%，ACE 抑制率隨著牡蠣多糖質(zhì)量濃度的增加而增加，具有質(zhì)量濃度依賴性。石璇等人[6]的研究表明，牡蠣多糖對(duì)高血壓模型Wistar大鼠具有較好的降血壓活性。但是，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，牡蠣多糖抑制ACE 的活性并不強(qiáng)，這表明降血壓模型的不同會(huì)導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生差異。另一方面，也說(shuō)明牡蠣多糖與ACE 的活性部位的結(jié)合不是很緊密或者沒(méi)有結(jié)合于ACE 的活性部位。

3 大鯢活性肽牡蠣多糖復(fù)合粉的ACE 抑制活性

通過(guò)大鯢活性肽牡蠣多糖復(fù)合粉的ACE 抑制活性測(cè)定試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大鯢活性肽牡蠣多糖復(fù)合粉具有一定的抑制ACE 活性。

大鯢活性肽牡蠣多糖復(fù)合粉ACE 抑制活性見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，在牡蠣多糖與大鯢活性肽溶液按體積比1∶1 混合時(shí)，即其中的牡蠣多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL，大鯢活性肽的質(zhì)量濃度為1mg/mL 時(shí)，對(duì)ACE 的抑制率達(dá)到61.27%，對(duì)照?qǐng)D1 與圖2 的結(jié)果，可以看出牡蠣多糖與大鯢活性肽復(fù)合粉在抑制ACE 活性時(shí)產(chǎn)生了協(xié)同作用，一定質(zhì)量濃度的牡蠣多糖與大鯢活性肽復(fù)合粉ACE 抑制率高于相應(yīng)質(zhì)量濃度的牡蠣多糖與大鯢活性肽的ACE 抑制率之和。

傳統(tǒng)降血壓藥卡托普利（Captopril） 是一種具有類多肽結(jié)構(gòu)的ACE 抑制劑[9]。由此可見(jiàn)，多肽結(jié)構(gòu)是ACE 抑制劑的潛在侯選對(duì)象。大鯢活性肽溶液與牡蠣多糖溶液混合，導(dǎo)致大鯢活性肽的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生了更好的ACE 抑制活性。

4 結(jié)論

通過(guò)體外ACE 抑制作用試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鯢活性肽具有較好的抑制ACE 作用，牡蠣多糖具有一定的抑制ACE 作用。大鯢活性肽牡蠣多糖復(fù)合粉在抑制ACE 活性時(shí)產(chǎn)生了協(xié)同作用，一定質(zhì)量濃度的大鯢活性肽牡蠣多糖復(fù)合粉對(duì)ACE 抑制率高于相應(yīng)質(zhì)量濃度的大鯢活性肽與牡蠣多糖對(duì)ACE 抑制率之和。研究結(jié)果為下一階段對(duì)大鯢肽牡蠣多糖復(fù)合粉在協(xié)同抑制ACE 作用的機(jī)理研究提供了良好的基礎(chǔ)，也為具有降血壓作用的大鯢肽牡蠣多糖復(fù)合粉保健食品的開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。