楊雪，宋飛，彭蕾，戶業(yè)麗，程波,*，丁強

1. 武漢工程大學環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，武漢 430205 2. 宜昌三峽制藥有限公司，宜昌443005

半個多世紀以來，全氟化合物(PFCs)作為合成化學品，由于其獨特的性質如疏水性和疏油性在商業(yè)和工業(yè)領域得到了廣泛的應用[1-2]。但由于它們在人類和野生動物中的生物蓄積性和環(huán)境中的持久性，在生物體內和環(huán)境中都有檢出，這使得PFCs引起了科學界和公眾的廣泛關注[3-4]。越來越多的證據(jù)表明，一些PFCs可能具有內分泌干擾效應[5]，同時擾亂甲狀腺系統(tǒng)和神經內分泌功能，激活過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)和雌激素受體(ERs)，并誘導嚙齒動物的發(fā)育毒性[6]。研究較多的PFCs有全氟辛烷磺酸(PFOS)，其可調節(jié)下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸中某些基因的表達水平，并導致斑馬魚幼魚中甲狀腺激素(TH)水平的變化，直接反映出對TH穩(wěn)態(tài)的破壞[7]。據(jù)報道，在動物實驗中，PFOS暴露會引起中樞神經系統(tǒng)功能的改變，包括神經內分泌紊亂和神經發(fā)育遲緩[8-9]。全氟辛酸(PFOA)作為一種在工業(yè)中廣泛使用的PFCs，其毒理效應研究主要集中在水生生態(tài)毒性，比如對藻類[10]、斑馬魚[11]、黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)[12]、稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)[13]、多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)和大型蚤(Daphniamagna)的毒性[14]。其中，斑馬魚胚胎模型的研究表明，PFOA能夠干擾ER和睪酮受體(TR)的合成。在人腎上腺皮質瘤細胞H295R細胞中，PFOA可以增加雌二醇(E2)的合成并降低睪酮(T)的合成，改變了主要的類固醇基因和調節(jié)因子SF-1的表達，表明了PFOA潛在的內分泌干擾作用[11]。

PFCs前體物的毒性效應研究相對于PFCs較少，特別是對于最近報道的一些新的前體物，如全氟碘烷烴(FIAs)。FIAs是一端含有碘原子的全氟化烷基鏈的化學品，是工業(yè)合成氟代調聚物醇(FTOH)和全氟辛酸銨(APFO)等調聚物的重要中間體[15]。全氟辛基碘烷(PFOI)就是其中一種重要的中間體，其衍生物的廣泛應用使得其具有較高的商業(yè)價值。然而，對這種化學物質的毒性效應研究甚少，僅有的研究報道了PFOI暴露對雄性青鳉的影響，雄性青鳉體內卵黃蛋白原(VTG Ⅰ和VTG Ⅱ)等雌激素相關基因的表達水平隨PFOI劑量的增加而上調，且表現(xiàn)出明顯的劑量-效應關系[16]。VTG被證明是理想的類雌激素暴露的生物標志物[17]，上述結果表明，PFOI是一種潛在的具有雌激素效應的類雌激素化合物，但是對PFOI其他毒性效應的研究仍是空白。

表觀遺傳學是毒性效應研究中不可忽略的一個重要研究方向，因為，它是環(huán)境化學品影響人類健康和導致疾病的重要機制[18]。已有研究提出，內分泌干擾效應有可能是通過干擾表觀遺傳途徑，進而導致不利的發(fā)育效應[19]。目前有研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在表觀遺傳機制的調控中扮演了越來越重要的角色[20]。有趣的是，近幾年的新證據(jù)表明，lncRNA的調節(jié)受到各種環(huán)境化學物質的影響，如多環(huán)芳烴、苯、鎘、甲基毒死蜱、雙酚A、鄰苯二甲酸鹽、苯酚和膽汁酸[21]。這些環(huán)境化學物質在表觀遺傳水平調控基因的表達，從而影響生物體內的信號傳遞和重要的生物學功能[22]，最終產生致毒效應。有研究表明，相對于正常乳腺組織，lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄本-1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript-1, MALAT-1)在原發(fā)性乳腺癌和淋巴結轉移中高表達[23]。據(jù)報道，阿魏酸(一種用于治療婦科疾病的中草藥主要成分之一，具有植物雌激素效應)可誘導MCF-7細胞中雌激素受體α(ERα)調控MALAT-1的表達，并且阿魏酸可提高MCF-7細胞活力、增殖、成瘤、遷移和侵襲的能力，且表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性關系[24]。此外，MALAT-1被證明在神經元中表達并調節(jié)與樹突和突觸發(fā)育相關的一系列基因[25-26]，且MALAT-1在酗酒者的小腦、海馬和腦干中顯著上調[27]。以上研究表明，MALAT-1既會與雌激素受體相互作用，也會參與神經調節(jié)，但是MALAT-1在PFOI暴露下的調節(jié)作用尚不明確。

生物信息學分析結果表明，MALAT-1在人、斑馬魚和老鼠之間具有一定同源性，主要表現(xiàn)在3’端有一段長約60 bp的高度相似序列[28]。故本研究以人乳腺癌細胞(MCF-7)為離體模型，研究PFOI暴露對MCF-7細胞遷移能力的影響，以及對MALAT-1的調節(jié)作用；以斑馬魚胚胎為活體模型研究PFOI暴露對斑馬魚胚胎的胚胎毒性及對MALAT-1的調節(jié)作用。初步了解PFOI環(huán)境暴露對乳腺癌患者的危害，以及對水生生物的生態(tài)毒性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗試劑

PFOI純度≥99%，購于北京百靈威科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO)純度≥99%，購于Amresco公司(美國)；RPMI 1640細胞培養(yǎng)液購于Invitrogen公司(美國)；胎牛血清(FBS)、100 U·mL-1鏈霉素-青霉素和谷氨酰胺均購于Gibco公司(美國)；活性炭-葡聚糖處理的胎牛血清(CDT-FBS)購于Cellgro公司(美國)。將PFOI溶于DMSO中，PFOI母液濃度為50 mmol·L-1(置于-20 ℃冰箱避光保存)。原位雜交所用去離子水出自Mini-Q超純水機(Miliipore公司，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)與暴露

液氮中取MCF-7乳腺癌細胞株，在解凍儀下37 ℃解凍1 min。培養(yǎng)基配方：基礎培養(yǎng)基RPM1640+10% FBS+1%谷氨酰胺+1%鏈霉素-青霉素。在37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3 d，第4天傳代培養(yǎng)。傳代2次后饑餓培養(yǎng)細胞12 h。之后暴露實驗中，將細胞培養(yǎng)基中10% FBS換為10% CDT-FBS。MCF-7細胞暴露在濃度分別為10 μmol·L-1和50 μmol·L-1的PFOI溶液中，空白對照組為0.1% DMSO。

1.3 細胞遷移實驗

細胞遷移實驗是一項癌細胞功能監(jiān)測實驗，用于分析細胞遷移能力。用胰酶消化細胞后計數(shù)，置于6孔板，每個孔細胞濃度為1×105～1×106個·mL-1。培養(yǎng)過夜，第2天換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基饑餓處理12 h之后，在6孔板底部劃線，再用無菌槍頭沿劃線處除去中央所有細胞。用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕洗去刮掉的細胞，用培養(yǎng)基稀釋暴露藥物至工作液濃度，暴露24 h，其中，分別在0、12和24 h拍攝細胞遷移狀況。遷移能力的大小用傷口未愈合百分比(% of wound open)表示，未愈合百分比越小表明遷移能力越大。

1.4 PFOI對lncRNA MALAT-1的調節(jié)

對暴露后的細胞和斑馬魚胚胎進行實時熒光定量PCR測定，細胞總RNA用Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)提取，用Thermo nanodrop 2000核酸測定儀(Thermo Fisher公司，美國)測定所提取的總RNA濃度，A260/A280的比值在1.8～2.0之間。使用iScriptTMcDNA合成試劑盒(Bio-Rad Laboratories, Inc.，美國)按照說明書進行cDNA的合成。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，并且使用SYBR Green Supermix試劑盒進行實時定量PCR，正向和反向引物序列如表1所示。每個反應3個重復樣品。使用2-ΔΔCT方法[29]計算相對表達水平的倍數(shù)變化。在離體細胞水平上，以GAPDH的表達量進行標準化來分析MALAT-1的表達水平。在活體模式生物斑馬魚體胚胎體內，以β-肌動蛋白(β-actin)的表達量進行標準化來分析MALAT-1的表達水平。

表1 用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)

1.5 斑馬魚暴露實驗

1.5.1 斑馬魚暴露與形態(tài)觀察

斑馬魚(Daniorerio)，AB野生型，購于中國科學院水生生物研究所，飼養(yǎng)于流水養(yǎng)殖系統(tǒng)(武漢漢科實驗設備研制有限公司)，最適水溫范圍(28±0.5) ℃，光周期為14 h光照周期和10 h暗周期。所有實驗均在野生型AB株(3個月齡)孵化的斑馬魚胚胎上進行。收集的胚胎由2條雌魚和2條雄魚配對產生，并在收集胚胎前一天的晚上用隔板分離。第2天拿開隔板自由配對產卵。之后挑取發(fā)育時期一致，質量較好的胚胎于6孔板中，每個孔約30枚胚胎暴露于PFOI溶液中。暴露液濃度分別為0、10、50、100、500和1 000 μmol·L-1。斑馬魚胚胎受精2 h后(2 hpf)暴露至120 hpf，暴露時間內每天更換約1/2新鮮配制的暴露液(暴露液由養(yǎng)魚水稀釋配成，養(yǎng)魚水以約0.06 g海鹽加入1 L的自來水中配制而成，充分溶解后曝氣)。每個暴露組有3個重復，對照組和實驗組的DMSO含量不超過0.007%。在暴露過程中，觀察胚胎的形態(tài)發(fā)育，記錄不同階段的死亡率、孵化率和畸形率。

1.5.2 斑馬魚胚胎自發(fā)運動行為的測定

對胚胎的早期自發(fā)運動的檢測在28～29 hpf進行(斑馬魚胚胎早期自發(fā)運動于17 hpf最為活躍)，此時，中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育已經開始抑制胚胎的早期自發(fā)運動，因而，這一階段的運動頻率較為穩(wěn)定，利于觀測。殘余的自發(fā)運動被認為是引起孵化的原因之一[30]。斑馬魚胚胎暴露于含不同濃度PFOI(0、10、50、100和500 μmol·L-1)環(huán)境中至32 hpf時(未出膜)，于32 hpf時通過斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)(DanioScope)，分析PFOI暴露對斑馬魚胚胎自發(fā)運動行為的毒性效應。觀察20枚胚胎，通過徠卡顯微鏡(DMi8, Leica, Mannheim, Germany)使用每秒24幀速度對胚胎進行視頻拍攝，之后通過DanioScope軟件對視頻文件進行多枚斑馬魚胚胎的活動分析，每個處理組有3個重復。該系統(tǒng)可以自動識別胚胎，選擇胚胎絨毛膜內作為感興趣區(qū)域，并自動測定胚胎活動。分析指標為斑馬魚胚胎的活躍性，用胚胎運動的時間百分比(占總測量時間的百分比)來表征。

1.5.3 整體原位雜交

(1) 胚胎前處理

用PFOI暴露之后，分別收集暴露至72 hpf的胚胎，用4%多聚甲醛固定4 ℃過夜，之后用PBS稀釋的甲醇(0、25%、50%、75%和100%)梯度溶液脫水，每個濃度一次，每次5 min，最后置于甲醇溶液中于-20 ℃保存并透化約一周。

(2) 探針制備

陽性對照引物序列上游引物為5’GATGTCGCCCTGTGGAGT3’，下游引物為5’TAATACGACTCACTATAGGGGGGATGCACGATTAGCAG3’。其中，下游引物前20個堿基屬于T7聚合酶基因序列。提取斑馬魚幼魚(120 hpf)的總RNA，通過逆轉錄合成cDNA，再根據(jù)體外轉錄程序來合成反義RNA作為探針。

(3) 原位雜交

第1天進行雜交實驗：用含甲醇的PBS溶液(100%、75%、50%、25%和0)梯度復水，每個濃度一次，每次5 min，復水完之后用含0.1% Tween20的PBS即PBT洗4次，每次5 min。蛋白酶K消化與4%多聚甲醛固定之后，加預雜交液，70 ℃水浴4 h進行預雜交，之后再加含有探針的雜交液于70 ℃雜交過夜。

第2天進行抗體孵育：用雜交液與氯化鈉和檸檬酸三鈉溶液(SSC)的混合液梯度漂洗，然后加封閉液(PBT中加入2%羊血清和2 mg·mL-1牛血清白蛋白(BSA))在室溫低速搖床上封閉反應4 h。最后加酶連地高辛抗體(Anti-dig-AP)于4 ℃搖床上低速反應過夜。

第3天進行顯色實驗：棄抗體反應液，PBT快速漂洗6次，每次5 min，然后用堿性Tris緩沖液快速漂洗3次，每次5 min。最后用顯色液(20 μL NBT-BCIP/1 mL堿性Tris緩沖液)進行顯色反應。顯色反應時嚴格避光。每30分鐘觀察一次胚胎顯色情況，直到顯色成功后，及時吸去顯色液，之后加入1 mL終止液(PBS的pH為5.5，含EDTA 1 mmol·L-1)，洗3次。最后將胚胎轉移至100%甘油中室溫過夜，增加胚胎的光透性。

第4天進行MALAT-1基因的原位觀察：在顯微鏡下將雜交好的胚胎置于白底板下觀察MALAT-1基因的原位表達情況。

圖1 在全氟辛基碘烷(PFOI)暴露下MCF-7細胞隨時間變化的遷移情況注：(a)、(b)和(c)分別為0、10和50 μmol·L-1的PFOI暴露組；1、2和3分別表示暴露時間為0、12和24 h；黃色線條標記的中間區(qū)域面積能夠反映MCF-7細胞遷移愈合能力，黃色區(qū)域面積越小，表明遷移能力越強。Fig. 1 Cellular migration with time of MCF-7 cells after exposure to 1-iodoperfluorooctane (PFOI)Note: (a), (b) and (c) represent 0, 10 and 50 μmol·L-1 of PFOI exposure group, respectively; 1, 2 and 3 represent 0, 12 and 24 h after exposure, respectively; the area of the middle area marked by the yellow line is negatively correlated with the migration ability of MCF-7 cells, which means the smaller the area of the yellow area, the stronger the migration ability.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用GraphPad Prism 7(Graphpad Software，La Jolla，CA，美國)和SPSS 22.0(IBM Corp.，Armonk，NY，美國)進行統(tǒng)計學分析，用Image J對細胞遷移實驗中傷口未愈合面積進行灰度分析。實驗結果表示為平均值±標準偏差(SD)或平均值±平均值的標準誤差(SEM)。使用單因素方差分析評估多個處理組(包括傷口未愈合百分比、基因表達和孵化率)。采用ANOVA與Dunnett’s post-test進行統(tǒng)計學分析，P<0.05被認為在統(tǒng)計學上具有顯著性。

2 結果(Results)

2.1 PFOI影響乳腺癌細胞的遷移能力

實驗結果表明，MCF-7細胞在PFOI暴露后，其遷移能力顯著增強，尤其是在高濃度的PFOI下。PFOI暴露組中MCF-7的遷移能力相對于對照組顯著性增高(圖1)。通過細胞的表觀觀察可知，在PFOI暴露處理12 h時，相對于對照組，MCF-7細胞遷移能力顯著性提高。通過Image J軟件對傷口面積進行定量分析可知，對照組與實驗組有顯著性差異。在暴露至12 h時，相對于對照組，10 μmol·L-1和50 μmol·L-1的PFOI暴露組中，細胞遷移能力分別提高了13%和39%(圖2)。

圖2 在PFOI暴露下MCF-7細胞遷移傷口未愈合百分比的定量分析注：數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標準誤差；**** P<0.0001表示暴露組與對照組之間的顯著差異。Fig. 2 A quantitative analysis of wound open percentage of cell migration of MCF-7 cells over time after exposure to PFOINote: Data are expressed as mean ± SEM; **** P<0.0001 indicates a significant difference between the exposed group and the control group.

2.2 PFOI對MCF-7細胞中MALAT-1的調節(jié)作用

對MALAT-1的表達量進行了定量分析，結果表明，于PFOI暴露24 h后，MCF-7細胞中MALAT-1的表達量顯著性增高。由圖3可知，與對照組相比，10 μmol·L-1和50 μmol·L-1的PFOI暴露組細胞中MALAT-1的表達量分別提高了7.1倍和9.2倍。

圖3 PFOI暴露24 h后MCF-7細胞MALAT-1的相對表達量注：數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標準誤差；**** P<0.0001表示暴露組與對照組之間的顯著差異。Fig. 3 Relative expression of MALAT-1 after exposure to PFOI for 24 h in MCF-7 cellsNote: Data are expressed as mean ± SEM; **** P<0.0001 indicates a significant difference between the exposed group and the control group.

2.3 PFOI誘導斑馬魚的胚胎毒性效應

對PFOI暴露下的斑馬魚胚胎毒性進行了研究，結果表明，在0～1 000 μmol·L-1濃度范圍內，在發(fā)育前期(<48 hpf)，斑馬魚胚胎的死亡率和畸形率雖無顯著性變化，但有顯著性的發(fā)育遲緩現(xiàn)象。形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚胚胎色素形成窗口期(約32 hpf)，POFI暴露組中，有較多斑馬魚胚胎表現(xiàn)出色素生成遲緩(圖4)。繼續(xù)暴露至72 hpf，500 μmol·L-1和1 000 μmol·L-1POFI暴露組的幼魚孵化率顯著性降低(表2)，繼續(xù)培養(yǎng)至96 hpf，幼魚由于不能及時出膜而死亡。

表2 斑馬魚幼魚暴露于PFOI的孵化率統(tǒng)計Table 2 Statistical hatching rate of zebrafish larvae exposed to PFOI

2.4 PFOI對斑馬魚幼魚自發(fā)運動的影響

在斑馬魚發(fā)育早期(約32 hpf)，通過測定斑馬魚胚胎的自發(fā)運動能力來評估PFOI對斑馬魚胚胎早期自發(fā)神經活動的毒性效應，結果表明，暴露濃度在50 μmol·L-1和100 μmol·L-1時，自發(fā)運動活力百分比相對于對照組分別顯著增加了1.01倍和1.1倍(P<0.05)(圖5)。結果表明，PFOI暴露導致斑馬魚胚胎早期發(fā)育的自發(fā)活動不受神經調節(jié)的控制而產生焦慮行為。

圖5 PFOI暴露至32 hpf時斑馬魚胚胎自發(fā)運動行為活力百分比注：數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標準誤差；* P<0.05表示暴露與對照組之間的顯著差異。Fig. 5 The percentage of burst activity for zebrafish embryos after exposure to PFOI until 32 hpfNote: Data are expressed as mean ± SEM; * P<0.05 indicates a significant difference between the exposed group and the control group.

2.5 PFOI對斑馬魚幼魚體內MALAT-1的調節(jié)作用

在PFOI的刺激下，斑馬魚幼魚體內MALAT-1表達量的定量分析結果表明，MALAT-1的表達量顯著性增高(圖6)。由實驗結果可知，相對于對照組，高濃度PFOI暴露組(100、500和1 000 μmol·L-1)中MALAT-1的表達分別增高了16倍、21倍和26倍。

圖6 PFOI暴露至120 hpf時斑馬魚胚胎MALAT-1的相對表達量注：數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標準誤差；**** P<0.0001、***P<0.001、** P<0.01表示暴露組與對照組之間的顯著差異。Fig. 6 Relative expression of MALAT-1 in zebrafish embryos after exposure to PFOI until 120 hpfNote: Data are expressed as mean ± SEM; **** P<0.0001, *** P<0.001 and ** P<0.01 indicate a significant difference between the exposed group and the control group.

2.6 MALAT-1在斑馬魚幼魚中的原位表達

原位雜交結果表明，斑馬魚幼魚在PFOI(0、100、500和1 000 μmol·L-1)暴露至72 hpf，MALAT-1的表達水平以PFOI劑量依賴關系顯著上調(圖7(c)、7(d)、7(e)和7(f))，且MALAT-1主要集中在斑馬魚胚胎的腦部表達(圖7(a)和圖7(b))。原位雜交的結果與實時熒光定量PCR結果相一致。

圖7 PFOI暴露至72 hpf時MALAT-1在斑馬魚胚胎的整體原位雜交注：(a)和(b)分別表示空白對照組與PFOI處理組暴露至72 hpf，斑馬魚胚胎的整體原位雜交成像，箭頭所指表示MALAT-1空間表達位置，比例尺為250 mm；(c)、(d)、(e)和(f)分別表示0、100、500和1 000 μmol·L-1 PFOI處理組的幼魚經過原位雜交后的成像，其中箭頭所指表示MALAT-1空間表達位置，比例尺為800 μm。Fig. 7 The MALAT-1 spatial expression in whole in situ hybridization of zebrafish embryos after exposure to PFOI until 72 hpfNote: (a) and (b) represent the whole in situ hybridization imaging of the zebrafish embryos in the control group and the PFOI treatment group until 72 hpf; the arrow indicates that the spatial expression position of MALAT-1 is mainly concentrated in the brain, and the scale is 250 mm; (c), (d), (e) and (f) represent the imaging of 0, 100, 500, and 1 000 μmol·L-1 PFOI-treated juveniles after in situ hybridization, where the arrow indicates that the MALAT-1 spatial expression position is mainly concentrated in the brain, and its expression is PFOI dose-dependent and has a scale of 800 μm.

3 討論(Discussion)

PFOI作為有機氟化物合成的重要中間體，具有較高的商業(yè)價值，但對其毒性效應的研究僅限于PFOI暴露可促進MCF-7細胞的增殖以及可誘導雄性青鳉魚體內VTG Ⅰ和VTG Ⅱ上調，表明PFOI具有雌激素效應[16]。本研究結合離體模型MCF-7細胞與活體動物模型斑馬魚胚胎來研究POFI急性暴露的毒性效應及對表觀遺傳修飾中l(wèi)ncRNA MALAT-1的調節(jié)作用。

離體模型研究結果表明，PFOI暴露加快了MCF-7細胞的遷移，同時誘導MALAT-1表達上調。對于細胞遷移與MALAT-1的調節(jié)之間的相關性，已有研究報道了MALAT-1通過競爭性結合miR-1作用于細胞分裂周期42蛋白(cell division cycle 42, cdc42)，進而誘導MCF-7的遷移和侵襲[31]。這說明，POFI暴露誘導MCF-7細胞中MALAT-1的上調，對加快癌細胞遷移有一定貢獻。此外，臨床數(shù)據(jù)表明，MALAT-1與雌激素受體相互作用，致使乳腺癌患者存活率降低[32]，筆者的研究也證實了PFOI環(huán)境暴露對乳腺癌的誘發(fā)和惡化具有一定的潛在影響。

斑馬魚胚胎活體模型的研究結果表明，PFOI的急性暴露具有一定的胚胎毒性，雖然，在胚胎發(fā)育早期(約32 hpf)沒有較為顯著的死亡和畸形現(xiàn)象，但在72 hpf(未出膜)時，胚胎死亡率顯著增高。早期發(fā)育所能觀察到的形態(tài)學毒性效應包括胚胎發(fā)育延遲、胚胎自發(fā)運動不受控制以及胚胎出膜率低。由于運動行為的成熟可能是基于發(fā)育過程中自發(fā)運動的神經性調控，當中樞神經系統(tǒng)受到影響時，自發(fā)運動變得不可控制，隨著時間的推移，殘余的自發(fā)運動活力越來越微弱，同時由神經支配自主運動受到阻礙，推測以上原因導致了斑馬魚在72 hpf時的孵化率顯著性降低，其實際致毒機理還需通過正反交實驗進行驗證。除此之外，筆者還在分子水平上測定了PFOI暴露對斑馬魚胚胎的毒性效應，通過qRT-PCR對PFOI暴露后的斑馬魚胚胎體內的MALAT-1相對表達量進行了測定，同時采用整體原位雜交技術觀測了MALAT-1的原位表達情況。結果表明，MALAT-1的相對表達量相對于對照組顯著性上調，且主要集中在腦部表達，少數(shù)在脊柱上表達。Ulitsky等[33]的研究表明，MALAT-1在各種組織中高表達，但主要在腦中富集，并調節(jié)與突觸和樹突發(fā)育相關的多個基因[34]，在突觸形成中起重要作用[35]。以上研究表明，MALAT-1的異常表達，對中樞神經系統(tǒng)正常調節(jié)具有一定的干擾作用。筆者的研究表明，在PFOI暴露下斑馬魚胚胎體內MALAT-1表達顯著性上調，結合自發(fā)運動研究結果，可以推測PFOI在活體里的形態(tài)學毒性效應可能與MALAL-1的調節(jié)有一定的相關性，并且表明PFOI可能具有潛在的神經毒性效應。

綜上所述，筆者首次通過聯(lián)合離體與活體實驗模型研究了PFOI的細胞毒性和胚胎毒性，發(fā)現(xiàn)PFOI可能是通過MALAT-1的調節(jié)作用誘導癌細胞遷移和自發(fā)運動過度活躍等毒性效應。

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