單秀民，彭 姣，陳業(yè)明

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

近年來(lái)有學(xué)者在對(duì)植物油料種子水相加工過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性蛋白酶，且發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)源性蛋白酶可以在特定的條件下水解自身的蛋白質(zhì)，還發(fā)現(xiàn)水解油質(zhì)蛋白的程度越大，破乳率越高[1-2]。油質(zhì)蛋白是穩(wěn)定油體結(jié)構(gòu)(脂肪存貯的細(xì)胞器)的重要蛋白質(zhì)[3]。組成油體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)包括油質(zhì)蛋白、油體鈣蛋白和油體固醇蛋白[4]。趙路蘋(píng)[1]在大豆粗油體中發(fā)現(xiàn)一種內(nèi)源性蛋白酶——半胱氨酸蛋白酶，可以水解油質(zhì)蛋白。陳雅靜[2]在對(duì)花生進(jìn)行濕法磨漿后離心分離，對(duì)獲得的上浮層(即粗油體，富含油脂和少量的蛋白質(zhì))進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中存在一種天冬氨酸蛋白酶，可以在一定條件下水解油體外源性蛋白(不組成油體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì))和油體內(nèi)源性蛋白，在溫度和酶的共同作用下，使得粗油體破乳率高達(dá)94.73%。研究[1,5]報(bào)道，葵花籽粗油體在35℃、pH 6.5時(shí)14.1～19.2 kDa 油質(zhì)蛋白會(huì)被水解，水浴9 h后17.3～19.2 kDa 油質(zhì)蛋白水解了34.89%，14.1 kDa油質(zhì)蛋白水解了29.07%；葵花籽粗油體在70℃和 pH 5下反應(yīng) 2 h，破乳率可達(dá)到 90%以上。這些研究表明植物油料種子中的內(nèi)源性蛋白酶具有一定的差異和較好的應(yīng)用前景。

目前，對(duì)葵花籽粗油體中內(nèi)源性蛋白酶的種類及其性質(zhì)的探究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文對(duì)葵花籽粗油體中內(nèi)源性蛋白酶系的性質(zhì)進(jìn)行探究及鑒定。通過(guò)濕法打漿，對(duì)葵花籽漿液進(jìn)行離心分離，獲得上浮層(即粗油體)和其他部分，其他部分可以進(jìn)一步加工處理制備蛋白粉。研究葵花籽粗油體中內(nèi)源性蛋白酶的最適水解pH、水解溫度和蛋白酶的鑒定，為葵花籽粗油體利用內(nèi)源性蛋白酶破乳提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葵花籽，購(gòu)于內(nèi)蒙古巴彥淖爾；氫氧化鈉、鹽酸，分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)；10～250 kDa標(biāo)準(zhǔn)蛋白，購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；其他試劑，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

上海瀘西90型磁力攪拌器，梅特勒臺(tái)式pH計(jì)，九陽(yáng)JYL-Y5破壁料理機(jī)，日本Himac CR-21GⅡ冷凍離心機(jī)，Mini-PROTEAN型垂直電泳儀，ChemiDoc XRS+凝膠成像儀,Q Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Fisher)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗油體的制備

將葵花籽去殼后加5倍的去離子水浸泡，置于4℃放置18 h，然后加入其原始質(zhì)量9倍的去離子水，使用九陽(yáng)破壁料理機(jī)以18 000 r/min的速度打漿2 min，后用四層紗布過(guò)濾將濾渣除去，濾液為葵花籽漿。將葵花籽漿置于冷凍離心機(jī)，保持4℃，4 000 r/min離心15 min，收集上浮層。上浮層即為葵花籽粗油體。

1.2.2 粗油體中內(nèi)源性蛋白酶系作用的最適pH和溫度的探究

將葵花籽粗油體用去離子水稀釋使其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為4 mg/mL,分為9份，分別調(diào)節(jié)pH至3、4、5、6、7、8、9、10、11后，置于50℃水浴2 h，取樣進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析。

將葵花籽粗油體用去離子水稀釋使其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為4 mg/mL,調(diào)節(jié)至作用的最適pH,分為6份，分別置于30、40、50、60、70、80℃水浴2 h，取樣進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.3 抑制劑對(duì)于粗油體中內(nèi)源性蛋白酶系的影響

參考Wilson等[6]的方法并作一定修改。向稀釋至4 mg/mL的粗油體中分別添加0、0.5、1 mmol/L AEBSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)，0、2、4 μmol/L Pepstatin-A(天冬氨酸蛋白酶抑制劑)，0、0.25、0.5 mmol/L E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制劑)，0、5、10 mmol/L EDTA-2Na(金屬蛋白酶抑制劑)后，調(diào)至pH 4，置于50℃進(jìn)行水浴，在0、2、4 h取樣，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.4 Tricine-SDS-PAGE分析

用去離子水將粗油體稀釋至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為4 mg/mL。取稀釋后的樣品0.5 mL 與0.5 mL Tricine-SDS-PAGE樣品緩沖液(0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)，1% SDS，2%巰基乙醇和0.02%溴酚藍(lán))混合[7]。置于沸水浴中煮3 min，冷卻后作為還原性Tricine-SDS-PAGE的上樣樣品。根據(jù)Schagger[8]的方法，使用16%的丙烯酰胺分離膠和4%的丙烯酰胺濃縮膠進(jìn)行。加入10 μL樣品于電泳泳道中，并以30 V、45 mA進(jìn)行電泳約1 h，直到藍(lán)色線(蛋白質(zhì)被溴酚藍(lán)染成藍(lán)色)進(jìn)入分離膠，然后再以100 V、45 mA進(jìn)行電泳，直至電泳結(jié)束。后經(jīng)過(guò)固定，考馬斯亮藍(lán)G-520染色，脫色干凈后使用Image Lab 3.0軟件分析條帶強(qiáng)度。

1.2.5 LC-MS/MS分析

將粗油體加入TCA使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，靜置4 h后，于8 000 r/min離心20 min，取沉淀進(jìn)行凍干，取適量的凍干粉加入40 μL 胰蛋白酶緩沖液，37℃ 孵育16～18 h。取水解液過(guò)0.22 μm水膜，然后經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，用MaxQuant1.5.5.1檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對(duì)內(nèi)源性蛋白酶活性的影響(見(jiàn)圖1)

葵花籽粗油體中含有多種油質(zhì)蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量分別是14.1、17.3、18.1、19.2 kDa，油體鈣蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分別是25 kDa和28 kDa，油體固醇蛋白相對(duì)分子質(zhì)量是37 kDa[9-10]?？ㄗ汛钟腕w中還含有大量外源性蛋白，分別是11S球蛋白和2S清蛋白。11S球蛋白的酸性肽鏈(11S-A)相對(duì)分子質(zhì)量在26～36 kDa，堿性肽鏈(11S-B)相對(duì)分子質(zhì)量在17～24 kDa[11]；2S清蛋白相對(duì)分子質(zhì)量在4～20 kDa[12]。

通過(guò)對(duì)圖1(a)的電泳圖進(jìn)行灰度分析得到圖1(b)，發(fā)現(xiàn)在pH 4、50℃下油質(zhì)蛋白水解速度最快，水浴2 h后相對(duì)于空白被水解59%。油質(zhì)蛋白在pH 3時(shí)水解速度較慢，2 h水解不到4%，在pH 5～pH 8，油質(zhì)蛋白水解相對(duì)較快。這說(shuō)明葵花籽粗油體中的內(nèi)源性蛋白酶系偏向于中酸性環(huán)境下水解油質(zhì)蛋白，且水解油質(zhì)蛋白的最佳pH是4。因?yàn)?1S球蛋白在所提取的葵花籽粗油體中的占比在80%以上，因此對(duì)占比較大的22 kDa(11S-B)球蛋白和35 kDa(11S-A)球蛋白進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)22 kDa球蛋白與油質(zhì)蛋白有著類似的水解規(guī)律，也是在pH 4的水解速度最快，但pH 3時(shí)的水解速度較快，當(dāng)pH大于5時(shí)，越往堿性方向偏移，水解速度越慢。而35 kDa球蛋白在pH 4～8水解速度較快，pH 3和pH 9～11均水解較慢。因此，pH 4是粗油體中絕大部分蛋白質(zhì)的最佳水解pH。

2.2 溫度對(duì)內(nèi)源性蛋白酶活性的影響

將稀釋后的粗油體調(diào)pH至4，置于30～80℃水解2 h，取樣進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2b可見(jiàn)，在pH 4時(shí)，油質(zhì)蛋白在50℃時(shí)水解速度最快，2 h可以水解59%左右。22 kDa球蛋白也在50℃水解程度最大，2 h可以水解28%，35 kDa球蛋白也有著相同的水解規(guī)律。

2.3 抑制劑對(duì)于內(nèi)源性蛋白酶活性的影響(見(jiàn)圖3)

從圖3和添加不同抑制劑后對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)的電泳圖以及22 kDa球蛋白與35 kDa球蛋白灰度分析結(jié)果(圖略)可知，Pepstatin-A的添加對(duì)于油質(zhì)蛋白、22 kDa和35 kDa球蛋白的水解均有一定的抑制效果，AEBSF對(duì)葵花籽粗油體中的蛋白也有微弱的抑制效果，而E-64的添加對(duì)粗油體中的蛋白水解并無(wú)影響，EDTA-2Na的抑制效果最為明顯，當(dāng)EDTA-2Na的濃度為5 mmol/L時(shí)，4 h后油質(zhì)蛋白剩余73%左右，22 kDa和35 kDa幾乎不水解，不添加抑制劑水解4 h油質(zhì)蛋白可以被完全水解，22 kDa被水解43%，35 kDa被水解69%左右，因此表明在pH 4時(shí)，金屬蛋白酶能水解葵花籽粗油體中的大部分蛋白質(zhì)。添加EDTA-2Na抑制劑后，很多條帶濃度均變深，原因有待進(jìn)一步研究。但抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不添加抑制劑水解 4 h油質(zhì)蛋白可以被完全水解，當(dāng)Pepstatin -A濃度為4 μmol/L時(shí)，4 h 后油質(zhì)蛋白還能被水解60%；當(dāng)AEBSF濃度為1 mmol/L時(shí)，4 h后油質(zhì)蛋白還能被水解90%，這表明還有其他酶類對(duì)油質(zhì)蛋白進(jìn)行水解。綜合4個(gè)電泳圖結(jié)果可知，在pH 4時(shí)，水解葵花籽粗油體中的蛋白質(zhì)的是金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。

2.4 內(nèi)源性蛋白酶系以及蛋白酶抑制劑的鑒定(見(jiàn)表1)

表1 蛋白酶與蛋白酶抑制劑LC/MS-MS鑒定結(jié)果

從表1可知，所提取得粗油體中1～9屬于金屬蛋白酶類，有CAAX prenyl protease 1 homolog isoform X 2(金屬肽酶M 48家族)、Amino peptidase M 1(氨肽酶M 1：金屬肽酶M 1家族)、Leucine amino peptidase1-like(亮氨酸氨肽酶：金屬肽酶)、Probable mitochondrial-processing peptidase subunitbeta, mitochondrial、Mitochondrial-processing peptidase subunitalpha-like、Signal peptidase complex catalytic subunit SEC 11 A-like、Mitochondrial-processing peptidase subunitalpha-like、Putative signal peptidase complex subunit 2、Probable mitochondrial-processing peptidase subunitbeta, mitochondrial。說(shuō)明體系中金屬蛋白酶主要是肽酶，且總的豐度在0.000 098 36。10～13是天冬氨酸蛋白酶類，有Aspartic proteinase Asp 1-like、Aspartyl protease AED3-like、Aspartyl protease family protein 2-like、Protein ASPARTIC PROTEASEIN GUARDCELL 1-like，且總豐度為0.000 296 13。14～15是絲氨酸蛋白酶，有Tripeptidyl-peptidase 2(三肽基肽酶)、Serine carboxy peptidase-like(絲氨酸羧肽酶)，且總豐度為0.000 117 34。沒(méi)有檢測(cè)到半胱氨酸蛋白酶類，這與抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在粗油體體系中天冬氨酸蛋白酶類的豐度大于絲氨酸蛋白酶類，絲氨酸蛋白酶類大于金屬蛋白酶類。但是抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示金屬蛋白酶類對(duì)粗油體中蛋白水解抑制程度最大，這可能是由于表1中序號(hào)為16～24等抑制劑存在的原因[13]。16～17是Kunitz抑制劑，其可以抑制絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶與天冬氨酸蛋白酶[14]。18～20是絲氨酸蛋白酶類抑制劑。21～24是半胱氨酸蛋白酶類抑制劑。在粗油體體系中并未鑒定出金屬蛋白酶類抑制劑。抑制絲氨酸蛋白酶類的抑制劑豐度可達(dá)到0.000 498 30，抑制天冬氨酸蛋白酶類的抑制劑豐度為0.000 441 23，這些抑制劑使得豐度較高的天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶作用弱于金屬蛋白酶。

3 結(jié) 論

葵花籽粗油體中存在內(nèi)源性蛋白酶系，此蛋白酶系在pH 4時(shí)油質(zhì)蛋白和11S球蛋白水解速度最快。油質(zhì)蛋白在pH 4～8水解速度相對(duì)較快，22 kDa球蛋白在pH 3～5水解速度相對(duì)較快，35 kDa球蛋白在pH 4～8水解速度相對(duì)較快。在pH 4條件下該蛋白酶系的最佳水解溫度是50℃。通過(guò)抑制劑添加實(shí)驗(yàn)和LC-MS/MS鑒定發(fā)現(xiàn)粗油體中存在金屬蛋白酶類、天冬氨酸蛋白酶類和絲氨酸蛋白酶類，且天冬氨酸蛋白酶類的豐度大于絲氨酸蛋白酶類，絲氨酸蛋白酶類大于金屬蛋白酶類。