杜天舒，朱澍，閆昭，張大偉，曹曉瑞

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京骨科醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西 西安 710032)

破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)被認(rèn)為是體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞類型，在骨代謝平衡中扮演著重要作用。破骨細(xì)胞過度活躍可導(dǎo)致多種骨疾病，如骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)假體松動(dòng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤、骨折后骨愈合延遲、Paget骨病等[1]，因此對破骨細(xì)胞生成和功能影響的研究一直是領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)重點(diǎn)。而破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)中分離和純化卻長期困擾著研究者?，F(xiàn)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞多利用原代細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞Raw 264.7。相比細(xì)胞系，利用原代細(xì)胞誘導(dǎo)來反映破骨細(xì)胞活性有一定優(yōu)勢，但其體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞始終效果不佳，文獻(xiàn)報(bào)道的誘導(dǎo)方法也不盡相同，無法有效套用。本研究通過研究純化前后C57BL/6小鼠原代骨髓細(xì)胞向破骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)的條件特點(diǎn)，總結(jié)利用原代細(xì)胞誘導(dǎo)技巧，提高誘導(dǎo)效率，為其體外研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠10只，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重在(20±2)g之間，健康狀況良好。

1.2 試劑與材料 α-MEM培養(yǎng)基，青霉素/鏈霉素、紅細(xì)胞裂解液(美國HyClone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司)；小鼠骨髓單核細(xì)胞分離液試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；抗小鼠CD11b熒光抗體(美國BD公司)；牛血清蛋白(bull serum albumin，BSA)(德國Bioforxx公司)；小鼠重組M-CSF(美國PeproTech公司)；小鼠重組RANKL(美國R&D systems公司)；TRAP染色試劑盒(美國Sigma公司)；TRAP活性檢測盒(南京建成生物工程研究所)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，q-PCR)引物(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠骨髓來源原代細(xì)胞獲取 脫頸處死小鼠，無菌條件下取股骨及脛骨，剔除骨質(zhì)周圍軟組織，用含1%青霉素/鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗，剪除兩側(cè)干骺端，5 mL無菌注射器抽取無血清α-MEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直到髓腔內(nèi)呈白色。1 000 rpm離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞吹打混勻，37℃裂解10 min，再次1 000 rpm離心5 min，棄上清后用含10% FBS，1%青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基重懸骨髓細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培育箱靜置培養(yǎng)。

1.4.2 小鼠骨髓單核/巨噬細(xì)胞獲取 收集過夜后骨髓原代細(xì)胞中未貼壁細(xì)胞，視為骨髓源性單核/巨噬細(xì)胞(bone marrow monocytes，BMMs)，即破骨細(xì)胞前體細(xì)胞。1 000 rpm離心5 min，用無血清α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞3次，離心后再用含10 %FBS，1%青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)，分別以ρ=5×105cells/cm2及ρ=2.5×105cells/cm2接種于96孔板及6 cm皿內(nèi)。

1.4.3 小鼠骨髓單核/巨噬細(xì)胞分離純化 利用1.4.1中骨髓原代細(xì)胞按照小鼠骨髓單核細(xì)胞分離液試劑盒說明分離純化出BMMs，以ρ=2.5×105cells/cm2接種于96孔板及6 cm皿內(nèi)。

1.4.4 小鼠骨髓單核細(xì)胞表面抗原鑒定 將1.4.2及1.4.3中BMMs計(jì)數(shù)后取至少106個(gè)細(xì)胞收集于四個(gè)EP管(1、2、3、4管)中，離心后去除培養(yǎng)基。1管及3管分別加入1% BSA 100 μL冰上封閉30 min，作為陰性對照。2管及4管加入0.5 μL抗小鼠CD11b熒光抗體，避光冰上靜置30 min。四管離心后分別加入PBS清洗，再加入適量多聚甲醛，轉(zhuǎn)移至流式管后上機(jī)檢測。

1.4.5 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 將1.4.2中鋪板細(xì)胞設(shè)為4組(A、B、C、D組)，A、B組細(xì)胞鋪板ρ=5×105cells/cm2，其中A組于細(xì)胞鋪板后即刻向96孔板及6 cm皿中加入20 ng/mL M-CSF及50 ng/mL RANKL，每2天換液，待第7天收樣，96孔板內(nèi)細(xì)胞行TRAP染色，6 cm皿中細(xì)胞提取mRNA行q-PCR檢測。B組于細(xì)胞鋪板后先用20 ng/mL M-CSF預(yù)處理3 d后，再一并加入50 ng/mL RANKL，之后每2天換液，待第7天收樣，96孔板內(nèi)細(xì)胞行TRAP染色，6 cm皿中細(xì)胞提取mRNA行q-PCR檢測。C、D組細(xì)胞接種密度ρ=2.5×105cells/cm2，誘導(dǎo)因子M-CSF及RANKL的加入方法分別同A、B組。將1.2.3中鋪板細(xì)胞設(shè)為E、F組，誘導(dǎo)因子M-CSF及RANKL的使用及誘導(dǎo)7 d后細(xì)胞收樣方式分別同A、B組。

1.4.6 破骨細(xì)胞TRAP染色 根據(jù)TRAP染色試劑盒說明對A～F組96孔板中細(xì)胞行TRAP染色，核≥3個(gè)的TRAP陽性細(xì)胞視為成熟破骨細(xì)胞。

1.4.7 破骨細(xì)胞TRAP活性檢測 根據(jù)TRAP活性試劑盒說明對A～F組6 cm皿中的細(xì)胞上清行TRAP活性檢測。

1.4.8 破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因的q-PCR檢測 將提取出的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA(cDNA)，q-PCR檢測破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因TRAP、組織蛋白酶(cathepsin K，CTSK)、活化T細(xì)胞核因子1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)、c-Fos的表達(dá)水平。目的基因引物序列見表1。

表1 q-PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞分析結(jié)果 未純化前小鼠骨髓原代細(xì)胞中CD11b陽性細(xì)胞比例約為(6±2)%，純化后CD11b陽性細(xì)胞比例約為(58±3)%，提示利用單核細(xì)胞分離液純化骨髓原代細(xì)胞后，其中單核細(xì)胞比例明顯增高(見圖1)。

a 未純化前骨髓原代細(xì)胞 b 純化后原代細(xì)胞

2.2 TRAP染色結(jié)果及定量分析 在M-CSF及RANKL的刺激下，細(xì)胞誘導(dǎo)第7天，各組細(xì)胞經(jīng)TRAP染色結(jié)果各不相同。各組破骨細(xì)胞數(shù)量比較，B、C、D組幾乎沒有TRAP陽性細(xì)胞出現(xiàn)[B組(3.30±0.67)個(gè)/孔，C組(5.67±0.87)個(gè)/孔，D組(4.00±0.58)個(gè)/孔]，提示無破骨細(xì)胞誘導(dǎo)生成。反之，與B、C、D組相比，A、E、F組中明顯可見數(shù)量不一的TRAP陽性細(xì)胞[A組(257.30±8.35)個(gè)/孔，E組(285.70±7.62)個(gè)/孔，F(xiàn)組(373.00±19.56)個(gè)/孔]。鏡下細(xì)胞多呈類圓形或不規(guī)則形，胞漿內(nèi)酒紅色TRAP陽性顆粒均勻沉淀，體積明顯較單核細(xì)胞大數(shù)倍，可達(dá)50～100 μm，多核(核≥3個(gè))，周邊可見偽足伸展，胞內(nèi)可見囊泡。其中F組中TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)量及面積較其他組更明顯(見圖2～3)。

2.3 TRAP活性結(jié)果 將細(xì)胞誘導(dǎo)7 d后收集各組培養(yǎng)上清行TRAP活性檢測，結(jié)果相比B、C、D三組[B組(10.00±1.16)U/L，C組(9.00±1.14)U/L，D組(6.67±1.45)U/L]，A、E、F組的細(xì)胞上清中TRAP活性明顯增高[(24.33±2.33)U/L，(28.67±2.03)U/L，(38.37±2.01)U/L)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)，提示同TRAP染色結(jié)果相一致，A、E、F組中明顯有大量破骨細(xì)胞生成。

2.4 q-PCR結(jié)果 相比B、C、D組，A、E、F組中破骨細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志性基因TRAP、CTSK、NFATc1及c-Fos的表達(dá)水平明顯增高(見表2，見圖5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在A、E、F組中有大量BMMs分化成為破骨細(xì)胞。

3 討 論

破骨細(xì)胞被認(rèn)為是體內(nèi)唯一具有骨吸收能力的細(xì)胞，其活性大小關(guān)系到整個(gè)機(jī)體的骨性質(zhì)量[2]。破骨細(xì)胞活性過小可導(dǎo)致骨硬化病，而活性過大則會引起骨質(zhì)疏松、骨折后骨愈合延遲、關(guān)節(jié)假體松動(dòng)、骨壞死等骨質(zhì)減少疾病[3]，從而嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，因此研究者對影響破骨細(xì)胞活性(包括分化或功能)的研究從未停滯過。破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究破骨細(xì)胞活性的基礎(chǔ)，但也是困擾研究者的難題。破骨細(xì)胞來源于造血干細(xì)胞譜系，是由多個(gè)單核/巨噬細(xì)胞融合而成，屬于高代謝終末分化細(xì)胞，具有不能傳代、生存時(shí)間短的特點(diǎn)[4-5]。利用原代細(xì)胞或單核/巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞系，通過誘導(dǎo)劑在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)法，近年來被廣泛用于破骨細(xì)胞的研究。細(xì)胞系誘導(dǎo)出來的破骨細(xì)胞純度高，數(shù)量多，均一性好，但隨著培養(yǎng)代數(shù)增加，細(xì)胞系會出現(xiàn)細(xì)胞生理性狀丟失可能，故在體現(xiàn)細(xì)胞性狀和細(xì)胞生物學(xué)特性方面遠(yuǎn)不及原代細(xì)胞。原代細(xì)胞擁有正常細(xì)胞形態(tài)，并且能夠體現(xiàn)出細(xì)胞在生物體內(nèi)所應(yīng)具備的標(biāo)記和功能，更接近生理狀態(tài)，由此獲得的數(shù)據(jù)具有更好相關(guān)性和更高價(jià)值。但利用原代細(xì)胞體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化破骨細(xì)胞往往難度較大，成功率不高，誘導(dǎo)質(zhì)量不佳。Guo等[6]取培養(yǎng)48 h后未貼壁骨髓原代細(xì)胞，以ρ=5×105cells/mL接種，加之50 ng/mLM-CSF+100 ng/mL RANKL進(jìn)行破骨細(xì)胞誘導(dǎo)；Kim等[7]取培養(yǎng)24 h后未貼壁骨髓原代細(xì)胞，30 ng/mL M-CSF預(yù)處理3 d后，以ρ=1×104cells/孔接種于96孔板，30 ng/mL M-CSF+100 ng/mL RANKL處理4 d以獲得成熟破骨細(xì)胞；Feng等[8]用35 ng/mL M-CSF處理BMMs后以ρ=8×103cells/孔接種于96孔板，35 ng/mL M-CSF+50 ng/mL RANKL處理5～7 d；Kang等[9]在10 ng/mL M-CSF條件下培養(yǎng)骨髓原代細(xì)胞24 h后取未貼壁細(xì)胞，50 ng/mL M-CSF預(yù)處理3 d后，以ρ=1×104cells/孔接種于96孔板，30 ng/mL M-CSF+50 ng/mL RANKL處理3～5 d?？梢娢墨I(xiàn)中有關(guān)利用原代細(xì)胞體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞報(bào)道的方法不盡相同，單位不統(tǒng)一，難以單純套用，還需研究者根據(jù)自身細(xì)胞特點(diǎn)摸索出合適的誘導(dǎo)方法，并且當(dāng)使用不同規(guī)格培養(yǎng)板/皿配合不同實(shí)驗(yàn)時(shí)還需換算接種密度，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且無法保證結(jié)果。因此，總結(jié)出便于研究者掌握的利用原代細(xì)胞體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的特點(diǎn)和方法技巧，具有十分重要的意義和價(jià)值。

a A組 b B組

c C組 d D組

e E組 f F組

圖3 TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)量化比較 圖4 各組誘導(dǎo)7 d細(xì)胞上清TRAP活性

表2 各組破骨細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志性基因的表達(dá)水平

a TRAP b CTSK

c NFATc1 d c-Fos

通過查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)研究中關(guān)于破骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)的接種密度各不相同，經(jīng)過換算范圍多集中在104 ～106 cells/cm2間，并且加入誘導(dǎo)劑M-CSF及RANKL的濃度及時(shí)機(jī)也不盡相同[6-10]。故我們按照不同接種密度(5×105cells/cm2和2.5×105cells/cm2)及誘導(dǎo)因子刺激方式(鋪板時(shí)直接加入M-CSF和RANKL，和先加入M-CSF預(yù)刺激3 d后再一并加入RANKL)設(shè)計(jì)A～D四組實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純利用過夜貼壁法收集得來的BMMs，用較低密度接種(ρ=2.5×105cells/cm2)，M-CSF & RANKL共刺激法和M-CSF預(yù)刺激法這兩種方式均無法成功誘導(dǎo)出成熟破骨細(xì)胞(C、D組)，當(dāng)提高接種密度后(如ρ=5×105cells/cm2)，相比M-CSF預(yù)刺激法，共刺激法可使BMMs成功分化為成熟破骨細(xì)胞。單核細(xì)胞純度對于破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)十分重要。通過測定，我們發(fā)現(xiàn)過夜后直接收集的細(xì)胞懸浮液中單核細(xì)胞純度約為6%，細(xì)胞接種密度過低，細(xì)胞間距過大，故M-CSF和RANKL無法起到誘導(dǎo)作用，破骨細(xì)胞無法融合形成。加大細(xì)胞接種密度以增加單位內(nèi)單核細(xì)胞數(shù)量，通過刺激單核/巨噬細(xì)胞可融合分化成破骨細(xì)胞。但不同于董偉[11]的研究，細(xì)胞經(jīng)過M-CSF預(yù)刺激后再接受M-CSF和RANKL共刺激，仍沒有形成破骨細(xì)胞。M-CSF可促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化，RANKL是破骨細(xì)胞分化過程中不可缺少的誘導(dǎo)因子[12-13]。我們認(rèn)為在單核細(xì)胞總數(shù)較少并伴有其他細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)混雜情況下，M-CSF會促使單核細(xì)胞貼壁并向成熟巨噬細(xì)胞方向分化，而后者幾乎喪失再融合分化成破骨細(xì)胞能力，故導(dǎo)致M-CSF預(yù)刺激組培養(yǎng)效果不佳(B組)[14-15]。RANKL的早期加入不僅可以協(xié)同增加M-CSF促細(xì)胞增殖及存活能力，而且還能促使單核細(xì)胞向未成熟巨噬細(xì)胞方向分化，并進(jìn)一步分化為破骨細(xì)胞(A組)[16-17]。當(dāng)我們通過分離液純化骨髓原代細(xì)胞，提高單核細(xì)胞純度(E、F組)后發(fā)現(xiàn)，即使以較低密度鋪板時(shí)，無論是何種誘導(dǎo)方式都能成功誘導(dǎo)出破骨細(xì)胞，且預(yù)刺激組誘導(dǎo)效果更佳。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過對骨髓原代細(xì)胞的處理，BMMs接種密度以及誘導(dǎo)方式這幾個(gè)方面進(jìn)行探索研究，總結(jié)利用原代細(xì)胞體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的一般特點(diǎn)，認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞懸浮液中單核細(xì)胞比例不高時(shí)，應(yīng)加大細(xì)胞接種密度以提高單核細(xì)胞數(shù)量，并在M-CSF刺激下盡早加入RANKL，促進(jìn)單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化；當(dāng)保證單位內(nèi)單核細(xì)胞數(shù)量前體下，可適當(dāng)降低細(xì)胞接種密度以減少細(xì)胞間接觸抑制影響，并可利用M-CSF預(yù)處理后再行與RANKL共誘導(dǎo)，從而提高破骨細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量，為下一步體外研究破骨細(xì)胞特點(diǎn)打下基礎(chǔ)。