張娜娜，張守梅，郭玉秋，陳利容，王興亞，龔魁杰

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東濟(jì)南 250100）

玉米是我國(guó)第一大農(nóng)作物，國(guó)家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2019年我國(guó)玉米總產(chǎn)量為26 077.89萬(wàn)噸，占糧食總產(chǎn)量的39.28%。當(dāng)前玉米栽培研究的目標(biāo)已由產(chǎn)量為主向高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、生態(tài)、安全等多目標(biāo)協(xié)同發(fā)展［1］，因此對(duì)玉米質(zhì)量安全提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，特別是受全球極端氣候變化影響，病蟲害加速發(fā)展嚴(yán)重影響玉米質(zhì)量和產(chǎn)量［2］。

穗腐病是目前玉米最嚴(yán)重的病害之一，主要由鐮刀屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和交鏈孢屬（Alternaria）真菌侵染導(dǎo)致［3，4］。玉米種子、生長(zhǎng)期、采收過(guò)程和儲(chǔ)藏過(guò)程中均可產(chǎn)生真菌污染。Mannaa等［5，6］對(duì)玉米收獲前和收獲后污染真菌的種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并提出，在收獲前有害真菌的種類更多，應(yīng)該從收獲前便開始采取措施控制真菌污染和真菌毒素的產(chǎn)生；Payne等［7］發(fā)現(xiàn)從吐絲期就有病原真菌從花絲侵入玉米穗中；王偉等［8］發(fā)現(xiàn)揚(yáng)花期接種黃曲霉菌的玉米發(fā)病率為25%，到灌漿期發(fā)病率為100%，說(shuō)明玉米生育期是控制玉米籽粒真菌和毒素污染的關(guān)鍵階段。目前還沒有對(duì)玉米生育期病原真菌污染和真菌毒素積累的相關(guān)調(diào)查或報(bào)道。本研究選擇三個(gè)常見玉米種植品種為研究對(duì)象，對(duì)每個(gè)生育階段的污染真菌進(jìn)行分離和鑒定，并對(duì)真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，以確定優(yōu)勢(shì)污染真菌的類型及相關(guān)產(chǎn)毒真菌與真菌毒素的關(guān)系，為進(jìn)一步科學(xué)合理地保障玉米采收和儲(chǔ)藏期間質(zhì)量安全奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用玉米樣品采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)示范基地濟(jì)陽(yáng)基地，玉米品種為鄭單958、青農(nóng)11和宇玉268。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；1%青霉素（10 000 U／mL）、硫酸鏈霉素（10 mg／mL），Biological Industries公司；丙三醇（甘油）、乙二胺四乙酸、無(wú)水磷酸二氫鈉（均為分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2×Taq DNA Master Mix、ITS通用引物，北京擎科生物技術(shù)有限公司；DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、DNA Dye 10000×，GenStar生物公司；嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮ELISA檢測(cè)試劑盒，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；IX51倒置顯微鏡，奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；立式高壓滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；臺(tái)式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3E酸度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；數(shù)顯恒溫振蕩水浴器，天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)儀器制造廠；恒溫金屬浴，杭州米歐儀器有限公司；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，Thermo Fisher科技（中國(guó)）有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，Eppendorf（中國(guó)）有限公司；PCR儀，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；水平電泳儀，Bio-Rad公司；NU Genius凝膠成像系統(tǒng)，Gene Company Limited；分析天平，德國(guó)賽得利斯有限公司；XW-80A旋渦混合儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 真菌分離和鑒定

1.3.1 真菌分離、純化 玉米花期套袋后進(jìn)行人工授粉，根據(jù)玉米籽粒發(fā)育程度，分別于授粉后0、12、23、35、44、55 d進(jìn)行采樣。采樣時(shí)，每個(gè)品種選擇生長(zhǎng)發(fā)育一致的植株，無(wú)病蟲害或明顯霉變，每個(gè)品種取30～50個(gè)帶苞葉果穗，裝入無(wú)菌自封袋中，當(dāng)天取樣當(dāng)天進(jìn)行污染真菌的分離。

在超凈工作臺(tái)中，取1 g樣品于含有10 mL滅菌蒸餾水的離心管中，渦旋振蕩10 s。采用稀釋平板法［9］，取1 mL混合液于9 mL滅菌蒸餾水中依次稀釋成 10-2、10-3、10-4濃度梯度的混合液。取100μL稀釋液涂布于含有1%青霉素和硫酸鏈霉素的無(wú)菌PDA培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度梯度做3個(gè)重復(fù)。將接種后的培養(yǎng)皿28℃左右培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并對(duì)真菌進(jìn)行純化，于無(wú)菌保種管4℃保存。

1.3.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上28℃進(jìn)行培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)至平板2／3時(shí)，觀察菌落大小、氣生菌絲狀態(tài)、菌落顏色和紋理等。

在超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌接種針挑取菌絲至滴有無(wú)菌水的載玻片上，于光學(xué)顯微鏡（40×10）下觀察菌絲和孢子形態(tài)。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定 選取形態(tài)不同的代表性菌株，采用熱裂解法［10］進(jìn)行真菌DNA基因組提取。利用引物 ITS1∶5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和 ITS4∶5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′對(duì)18S rDNA的 ITS序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增［11］，擴(kuò)增體系（25μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ITS1和 ITS4引物各 1μL、DNA模板 1μL、ddH2O 9.5μL。擴(kuò)增程序：95℃ 3 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共 35個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保存?zhèn)溆?。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果用Geneious 8.0.3軟件進(jìn)行分析和校正，得到的高質(zhì)量DNA序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的GenBank中進(jìn)行同源序列Blast比對(duì)，尋找具有較高同源性的核苷酸序列。將各類菌株序列導(dǎo)入Mega 7.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)（alignment）分析，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 真菌毒素檢測(cè)

1.4.1 樣品處理 黃曲霉毒素B1：粉碎并稱取鮮食玉米樣品5.0 g，置入100 mL具塞三角瓶中，加入60%甲醇溶液25 mL于振蕩器200 r／min振蕩10 min；4 000 r／min離心 5 min，取上清液 1 mL，加入4 mL去離子水后渦旋混合5 s，調(diào)節(jié)pH值至7～8之間。

嘔吐毒素：粉碎并稱取鮮食玉米樣品5.0 g，置入100 mL具塞三角瓶中，加入25 mL去離子水，于 150 r／min振蕩器上振蕩 10 min；4 000 r／min離心5 min，取上清液 1 mL，加入 4 mL去離子水后渦旋混合5 s。

玉米赤霉烯酮：粉碎并稱取鮮食玉米樣品5.0 g，置入100 mL具塞三角瓶中，加入60%甲醇溶液 50 mL于振蕩器150 r／min振蕩 10 min；4 000 r／min離心 5 min，取上清液 0.5 mL，加入4.5 mL去離子水渦旋振蕩5 s以充分混勻。

1.4.2 檢測(cè)步驟 每孔加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，再分別加入對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)物50μL，抗試劑50 μL，輕輕振蕩混勻，蓋板膜蓋板置25℃避光反應(yīng)30 min。揭開蓋板膜，甩干液體，用對(duì)應(yīng)的毒素洗滌液250μL洗滌4～5次，每次間隔10 s，并用吸水紙拍干。依次加入底物顯色A液50μL和底物顯色B液50μL，輕輕振蕩混勻，蓋板膜蓋板25℃避光反應(yīng)15 min。加入終止液50μL，振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀分別于450 nm和630 nm進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，測(cè)定每孔OD值。

1.4.3 結(jié)果判定

式中，B表示標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值；B0表示0 μg／kg標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值。

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg／kg）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣品的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為樣本中真菌毒素實(shí)際含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)處理均測(cè)定3次，取3次平均值作為測(cè)定結(jié)果。采用Origin 8.5和Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖；運(yùn)用Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）；產(chǎn)毒真菌與毒素積累相關(guān)性采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米籽粒發(fā)育期間污染真菌分離與鑒定

2.1.1 形態(tài)鑒定 參考《真菌鑒定手冊(cè)》［12］對(duì)玉米籽粒主要污染真菌菌落顏色、菌落質(zhì)地和分生孢子形態(tài)進(jìn)行初步鑒定。鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量棉絮狀氣生菌絲，并產(chǎn)生紫紅色色素；大型孢子多細(xì)胞，兩端尖而彎曲呈鐮刀型（圖1 A）。黃曲霉菌落初略帶黃色，后漸變黃綠色，終成褐色；分生孢子圓形，呈串珠狀（圖1 B）。青霉菌落綠色、青綠色或灰綠色；分生孢子梗聚成孢梗束，頂端生排列成帚狀的間枝；分生孢子串呈不分枝的鏈狀，單個(gè)孢子球形、卵圓形或橢圓形（圖1 C）。毛霉氣生菌絲發(fā)達(dá)，在PDA培養(yǎng)基橫向生長(zhǎng)，呈棉絮狀或羊毛狀，初為白色漸變?yōu)榛液谏蚧液稚?；孢子囊較大，孢子球形、橢圓形或不規(guī)則（圖1 D）。

圖1 污染真菌的菌落和孢子形態(tài)

2.1.2 分子鑒定 對(duì)菌株18S rDNA的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)約500 bp的片段，通過(guò)Blast比對(duì)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果（圖2）表明，F(xiàn)ungus 1＃與 Fusarium fujikuroi同源性最高，F(xiàn)ungus 2＃與Fusarium oxysporum同源性最高，F(xiàn)ungus 3＃與Fusarium verticillioides同源性最高，F(xiàn)ungus 4＃與Penicillium oxalicum同源性最高，F(xiàn)ungus 5＃與Aspergillus flavus同源性最高，F(xiàn)ungus 6＃與Mucor irregularis同源性最高。因此可以鑒定Fungus 1＃～6＃依次為藤倉(cāng)鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、草酸青霉、黃曲霉和多變根毛霉。

圖2 基于18SrDNA序列構(gòu)建的優(yōu)勢(shì)真菌菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 玉米籽粒發(fā)育期間優(yōu)勢(shì)污染真菌分析

如表1所示，污染真菌以鐮刀菌和青霉為主，其次是黃曲霉和毛霉，還有極少量其他類型真菌。從各發(fā)育期來(lái)看，授粉后0～23 d，玉米籽粒處于授粉、灌漿和乳熟階段，真菌污染率較低，在0.1% ～1.3%之間；授粉后35～55 d，玉米處于蠟熟期和完熟期，真菌污染率比授粉初期明顯增加，鐮刀菌和黃曲霉在授粉后45 d的污染率最高。從品種角度分析，鄭單958和宇玉268籽粒均在授粉后45 d真菌污染率達(dá)到最大值，青農(nóng)11在授粉后55 d真菌污染率達(dá)到最大值。

表1 三個(gè)玉米品種籽粒發(fā)育期間污染真菌及菌相分布

2.3 玉米籽粒發(fā)育期間毒素積累分析

三個(gè)玉米品種隨籽粒發(fā)育嘔吐毒素含量變化情況如圖3A所示。青農(nóng)11在授粉后45 d嘔吐毒素含量達(dá)到最大值，為（33.33±2.75）μg／kg，與其他兩個(gè)品種差異顯著（P＜0.05）；鄭單958嘔吐毒素含量在授粉后55 d達(dá)到最大值，為（28.99±1.91）μg／kg，與其他兩個(gè)品種差異顯著（P＜0.05）；宇玉268在授粉后23 d達(dá)到最大值，為（25.68±1.8）μg／kg，與其他兩個(gè)品種差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明玉米籽粒發(fā)育期間嘔吐毒素含量的變化受品種和生育期影響較大。

鄭單958、青農(nóng)11和宇玉268黃曲霉毒素B1含量最大值均出現(xiàn)在授粉后0 d，分別為（0.190±0.036）μg／kg、（0.203±0.033）μg／kg、（0.171±0.006）μg／kg。黃曲霉毒素 B1含量在授粉后先下降，之后呈現(xiàn)平穩(wěn)上升的趨勢(shì)，青農(nóng)11和宇玉268在授粉后第45 d再次達(dá)到峰值，分別為（0.195±0.018） μg／kg和 （0.152±0.02）μg／kg，鄭單 958在第 55 d再次達(dá)到峰值，為（0.172±0.02）μg／kg，且三者與授粉期相比略有減少但差異不顯著（P＞0.05）（圖3 B），說(shuō)明玉米籽粒發(fā)育期間黃曲霉毒素B1含量是動(dòng)態(tài)變化的，受真菌污染和外界環(huán)境因素影響較大。

鄭單958和宇玉268玉米赤霉烯酮含量均在授粉后第55 d達(dá)到最高值，青農(nóng)11在第45 d達(dá)到最高值。與嘔吐毒素和黃曲霉毒素B1相比，玉米赤霉烯酮含量變化比較平穩(wěn)，籽粒各個(gè)發(fā)育階段之間差異不顯著（P＞0.05），但品種之間具有一定差異。青農(nóng)11玉米赤霉烯酮含量高于鄭單958，除第23 d外，其他時(shí)間均差異不顯著（P＞0.05）；宇玉268玉米赤霉烯酮含量在各個(gè)階段均顯著低于其他兩個(gè)品種（P＜0.05）（圖3C）。

2.4 玉米籽粒發(fā)育期間主要產(chǎn)毒真菌與真菌毒素相關(guān)性分析

嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮的產(chǎn)毒真菌主要是鐮刀屬真菌［13］，黃曲霉毒素 B1的產(chǎn)毒真菌主要是黃曲霉等真菌［14，15］。Pearson相關(guān)系數(shù)反映了兩個(gè)變量之間的親密度和方向，絕對(duì)值在0～0.1之間表示沒有相關(guān)性，0.1～0.3之間表示弱相關(guān)，0.3～0.5之間表示中等相關(guān)，大于0.5表示強(qiáng)相關(guān)［16］。根據(jù)分析結(jié)果（表2），嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮與鐮刀菌含量之間相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值均小于0.5，且不具有顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮含量與鐮刀菌之間弱相關(guān)或不相關(guān)；黃曲霉毒素B1與黃曲霉的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值均大于0.4，且具有顯著（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明黃曲霉毒素 B1含量與黃曲霉具有一定的相關(guān)性。

圖3 玉米籽粒發(fā)育期間真菌毒素含量變化

表2 主要產(chǎn)毒真菌與真菌毒素相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

研究玉米籽粒發(fā)育期間污染真菌和真菌毒素積累規(guī)律，可以更好地控制真菌在玉米收獲時(shí)和倉(cāng)儲(chǔ)期間生長(zhǎng)，保障玉米質(zhì)量安全。本試驗(yàn)在玉米籽粒發(fā)育期間分離出的優(yōu)勢(shì)污染真菌多為玉米穗腐病的致病菌，經(jīng)形態(tài)鑒定和基于18S rDNA的ITS測(cè)序序列，確定污染真菌分別是輪枝鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、藤倉(cāng)鐮刀菌、草酸青霉、黃曲霉和多變根毛霉，與丁夢(mèng)軍等［17］對(duì)山東省玉米穗腐病優(yōu)勢(shì)病原菌的分離鑒定結(jié)果基本一致。鐮刀菌在玉米籽粒發(fā)育期間污染率最高，與孫華等［18］從黃淮海夏玉米主產(chǎn)區(qū)分離的優(yōu)勢(shì)真菌類型一致。本研究發(fā)現(xiàn)玉米籽粒在授粉后0～23 d即有真菌污染，授粉后35～55 d真菌污染率明顯增加，金柳艷等［19］在對(duì)夏玉米籽粒乳熟期到完熟期帶菌檢測(cè)分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，表面無(wú)癥狀的玉米籽粒在乳熟期即攜帶大量病原真菌，且完熟期帶菌量顯著高于乳熟期，與本研究結(jié)果一致。

對(duì)玉米籽粒發(fā)育期間真菌毒素含量變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同品種的玉米真菌毒素的變化趨勢(shì)基本一致，黃曲霉毒素B1含量變化在品種之間差別不顯著，但宇玉268玉米赤霉烯酮含量顯著低于鄭單958和青農(nóng)11，這可能與不同品種玉米穗苞葉長(zhǎng)度、緊實(shí)程度、花絲強(qiáng)度等玉米本身的特性有關(guān)［20］。不同毒素含量的變化趨勢(shì)有所不同，嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮含量在籽粒發(fā)育后期均大于授粉期，而嘔吐毒素積累量更高，說(shuō)明兩種毒素均處于動(dòng)態(tài)積累過(guò)程，且與產(chǎn)毒真菌鐮刀菌不具有相關(guān)性；黃曲霉毒素B1含量在授粉后下降，之后逐漸升高，籽粒發(fā)育后期低于授粉期，且與產(chǎn)毒真菌黃曲霉具有一定的相關(guān)性。可能是因?yàn)殓牭毒舅嘏c鐮刀菌類型、溫度、氧、水分活度等［21-23］條件有關(guān)；黃曲霉孢子發(fā)達(dá)，在吐絲期即可通過(guò)氣流或水滴從花絲進(jìn)入玉米穗，具有更有利的產(chǎn)毒條件［8］；嘔吐毒素最適產(chǎn)生溫度是15～25℃，玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1的最適產(chǎn)生溫度均在 30℃左右［24，25］，玉米籽粒發(fā)育處于九、十月份，氣溫涼爽，更適合嘔吐毒素的積累。本次調(diào)查可為調(diào)節(jié)玉米采收后的儲(chǔ)藏條件、控制真菌毒素的生成、保障玉米質(zhì)量安全提供技術(shù)依據(jù)。