李璐璐，駱延波，張慶，趙效南，任金瑞，2，胡明，張印，齊靜，劉玉慶

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所／山東省畜禽疫病防控與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是存在于豬上呼吸道的一種共棲菌［1］，也是一種條件性致病菌，可以在豬抵抗力較弱或者病毒感染后易感，引起以漿液性或纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等為特征的Gl?serser病，也稱(chēng)為副豬嗜血桿菌病［2］。副豬嗜血桿菌病多發(fā)于保育仔豬和青年豬［3］，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%以上［4］。

目前對(duì)于副豬嗜血桿菌的檢測(cè)主要采用PCR方法，包括普通 PCR［5］、實(shí)時(shí) PCR［6］、熒光定量 PCR［7，8］、多重 PCR［9］等。PCR檢測(cè)的特異性和靈敏性毋庸置疑，但是需要昂貴的PCR擴(kuò)增儀和凝膠成像系統(tǒng)。Notomi等［10］在2000年發(fā)明了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，針對(duì)靶基因序列的6個(gè)區(qū)域，設(shè)計(jì)4條引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換作用，在恒溫條件下進(jìn)行高效特異的擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP技術(shù)目前已經(jīng)用于多種臨床常見(jiàn)細(xì)菌的鑒定，如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、銅綠假單胞菌等［11-13］，以及細(xì)菌耐藥基因和毒力基因的檢測(cè)［14，15］。本研究擬采用LAMP技術(shù)，建立一種針對(duì)Hps的快速檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的特異性和靈敏度進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株 大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、糞腸球菌（ATCC 29212）、豬鏈球菌（ATCC 43765），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；30份帶有明顯呼吸道癥狀的豬肺樣品，用于LAMP方法的驗(yàn)證。

1.1.2 試劑與儀器 胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），OXOID公司產(chǎn)品；小牛血清，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；輔酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD），Sigma公司產(chǎn)品；脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法）、LAMP濁度實(shí)時(shí)分析儀（LA-320C）、熒光目視檢測(cè)試劑盒（SLP221），榮研生物科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀、分光光度計(jì) Nanodrop 2000，美國(guó)Bio-rad產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 病原菌的分離與基因組DNA的提取

將30份豬肺樣品在無(wú)菌條件下使用接種環(huán)劃線(xiàn)接種于TSA培養(yǎng)基（5%小牛血清＋1%的2 μg／mL NAD），37℃恒溫培養(yǎng) 20～24 h。在 TSA培養(yǎng)基上挑取針尖大小、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)、無(wú)色近似透明的菌落，再次劃線(xiàn)接種于TSA培養(yǎng)基，進(jìn)行純培養(yǎng)后，挑取單個(gè)疑似菌落接種于TSB培養(yǎng)基（5%小牛血清 ＋1%的 2μg／mL NAD）中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h后，通過(guò)水煮法提取模板DNA。

將純化后的大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌分別劃線(xiàn)于TSA培養(yǎng)基，豬鏈球菌劃線(xiàn)于添加5%小牛血清的TSA培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)18～20 h后，挑取單個(gè)疑似菌落接種于TSB培養(yǎng)基或添加5%小牛血清的TSB培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h后，按照天根生化科技有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取相關(guān)菌株的基因組。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的Hps 16S rRNA序列，采用Blast獲得高度保守區(qū)域。針對(duì)保守區(qū)域序列，根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)原則，使用藍(lán)譜公司Primer Explorer V5軟件 （http：／／primerexplorer.jp／lampv5e／index.html）設(shè)計(jì)3組引物（分別標(biāo)記為HP-1L、HP-2L和HP-3L），每組引物均包含一對(duì)外引物（F3和B3）和一對(duì)內(nèi)引物（FIP和BIP）。為提高擴(kuò)增效率，對(duì)篩選出的最佳引物組設(shè)計(jì)一條或兩條環(huán)引物（LF和LB）。PCR引物序列參考之前的文獻(xiàn)報(bào)道［5］。

1.4 反應(yīng)體系的建立

LAMP反應(yīng)體系（25μL）：2×反應(yīng)緩沖液（RM）12.5μL，Bst聚合酶 1μL，F(xiàn)IP和 BIP各0.4μL，F(xiàn)3和 B3各 0.1μL，模板 DNA 2.0μL，加ddH2O至25μL。

PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×Taq PCR反應(yīng)液10μL，16SrRNA-F和16SrRNA-R各1μL，DNA模板2μL，加 ddH2O至25μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化

選擇Hps 16SrRNA呈陽(yáng)性的H21菌株作為陽(yáng)性對(duì)照株，進(jìn)行LAMP反應(yīng)最佳引物組和最佳反應(yīng)溫度的篩選以及靈敏度、特異性試驗(yàn)。

1.5.1 最佳引物組的篩選 將Hps的16S rRNA的3組引物按上述反應(yīng)體系分別配置后，65℃恒溫反應(yīng) 60 min后，80℃恒溫反應(yīng) 5 min，根據(jù)LAMP濁度儀實(shí)時(shí)記錄的650 nm的濁度值繪制濁度曲線(xiàn)，以最先出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)并且擴(kuò)增效率較高的引物組為最佳引物組。選擇特異性好的引物組，根據(jù)需要設(shè)計(jì)環(huán)引物，再進(jìn)行特異性驗(yàn)證，從而篩選出最佳引物組。

1.5.2 最佳反應(yīng)溫度的篩選 使用篩選出的最佳引物組，分別于60～67℃擴(kuò)增60 min，繪制濁度曲線(xiàn)，選擇擴(kuò)增反應(yīng)最早出現(xiàn)、擴(kuò)增效率較高的溫度為最佳反應(yīng)溫度。

1.6 LAMP靈敏度測(cè)試

使用Nanodrop 2000測(cè)定H21菌株基因組DNA濃度，然后用滅菌去離子水將模板濃度調(diào)至1 ng／μL進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。繼續(xù)對(duì) 1 ng／μL的DNA進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋?zhuān)褂猛瑯拥囊唤MDNA模板進(jìn)行LMAP反應(yīng)和PCR擴(kuò)增，比較兩種方法的靈敏度。

1.7 LAMP特異性測(cè)試

首先使用5株標(biāo)準(zhǔn)菌株和H21進(jìn)行LAMP反應(yīng)特異性試驗(yàn)。之后選取30份臨床采集的豬肺樣品的DNA作為樣本，采用LAMP和PCR兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的符合程度。

1.8 試驗(yàn)結(jié)果的判讀

1.8.1 LAMP結(jié)果判讀 包括兩種方式：（1）LA-320C儀器每6 s測(cè)定一次反應(yīng)管中的濁度，可根據(jù)濁度繪制實(shí)時(shí)的濁度曲線(xiàn)圖［16］。按照實(shí)驗(yàn)儀器的說(shuō)明書(shū)，一般濁度＞0.1時(shí)，認(rèn)為反應(yīng)結(jié)果呈陽(yáng)性。（2）在LAMP反應(yīng)中，DNA延伸時(shí)脫氧核酸三磷酸基質(zhì)（dNTPs）中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子結(jié)合，生成一種焦磷酸鎂衍生物的白色沉淀物［17］，因此使用肉眼觀察是否有白色沉淀，即可判斷反應(yīng)擴(kuò)增與否。

1.8.2 PCR結(jié)果判讀 取 PCR產(chǎn)物5μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察有無(wú)條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳引物組的篩選

以H21基因組DNA為模板，分別以HP-1L、HP-2L和HP-3L為引物，濁度監(jiān)測(cè)60 min并繪制濁度曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1。相同溫度和反應(yīng)條件下，引物HP-1L和HP-3L出現(xiàn)明顯擴(kuò)增，并且這兩組引物出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間差不多，但HP-1L的擴(kuò)增效率明顯高于HP-3L。對(duì)這兩組引物組設(shè)計(jì)環(huán)引物，HP-1L引物組可設(shè)計(jì)出一組環(huán)引物（LF和LB），而HP-3L引物組只有一個(gè)環(huán)引物L(fēng)B。進(jìn)行特異性試驗(yàn)后，最終選擇HP-1L＋LF＋LB為試驗(yàn)引物組，引物序列見(jiàn)表1。

圖1 不同擴(kuò)增引物下的濁度曲線(xiàn)

表1 LAMP和PCR方法的引物序列

2.2 最佳溫度的篩選

以H21基因組DNA為模板，以表1中LAMP序列作為引物，分別在60～67℃進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的濁度結(jié)果繪制濁度曲線(xiàn)（圖2）。當(dāng)反應(yīng)溫度為64、65、66℃時(shí)，最先發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。由于64℃時(shí)的擴(kuò)增效率比較高，因此設(shè)定64℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖2 不同溫度下的濁度曲線(xiàn)

2.3 LAMP方法的特異性檢測(cè)

以H21作為陽(yáng)性對(duì)照菌株，ddH2O作為陰性對(duì)照，使用5株標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證LAMP方法的特異性，結(jié)果（圖3）表明，本研究中建立的 Hps 16SrRNA的LAMP方法具有較高的特異性，可特異性檢測(cè)Hps。

圖3 LAMP特異性試驗(yàn)

2.4 LAMP方法的靈敏度檢測(cè)

以1 ng／μL的模板DNA為基礎(chǔ)進(jìn)行10倍稀釋后，選擇1～10-6ng／μL的7個(gè)濃度為模板，分別進(jìn)行LAMP和PCR的擴(kuò)增。由圖4可以看出，LAMP反應(yīng)的最低檢測(cè)限為10-4ng／μL，PCR反應(yīng)的最低檢測(cè)限也為10-4ng／μL，LAMP方法與PCR的靈敏度相當(dāng)。由圖4 A可以看出，當(dāng)DNA濃度分別為1 ng／μL和10-4ng／μL時(shí)，反應(yīng)時(shí)間分別為22 min和39 min?？紤]到樣品的復(fù)雜性，因此將LAMP方法的反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為45 min。

2.5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)采集的30份豬肺臨床樣品進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12份結(jié)果為陽(yáng)性；利用常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè)，與LAMP結(jié)果吻合，證明LAMP方法可在臨床樣品中特異性檢測(cè)Hps。

圖4 LAMP和PCR反應(yīng)靈敏度試驗(yàn)

3 討論與結(jié)論

目前針對(duì)Hps的PCR鑒定主要使用3個(gè)靶基因，分別為16SrRNA基因、infB基因和OMP基因。16SrRNA基因在細(xì)菌各種屬之間具有高度保守性，被廣泛用于細(xì)菌之間的種屬鑒定。

國(guó)內(nèi)外對(duì)Hps快速檢測(cè)的LAMP方法已有研究。Zhang［18］、Chen［19］等均根據(jù) infB基因建立了Hps的 LAMP方法，兩者的檢測(cè)限分別為10 CFU／mL和 5拷貝／管。魏曉媛［20］根據(jù) OMP P2基因建立了LAMP方法，其檢測(cè)限為0.2 pg／μL。根據(jù)Hps的16S rRNA基因建立的LAMP方法，其檢測(cè)限為 0.3～0.68 pg［21，22］及 0.2～0.241 pg／μL［23，24］。本試驗(yàn)建立的 LAMP方法靈敏度與PCR方法相當(dāng)，但比上述方法靈敏。此外，上述LAMP方法的反應(yīng)時(shí)間均在50～65 min，本研究建立的LAMP方法反應(yīng)時(shí)間為39 min，比之前報(bào)道的LAMP方法更適用于Hps的快速檢測(cè)。

LAMP被認(rèn)為是快速檢測(cè)核酸的一種方法，具有高特異性和高靈敏度，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類(lèi)和動(dòng)植物中。LAMP方法與PCR方法相比，成本低廉，不需要昂貴的儀器設(shè)備，即可使用Bst聚合酶達(dá)到快速反應(yīng)的目的。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，本研究建立的LAMP檢測(cè)方法具有耗時(shí)短、成本低廉、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，尤為適合基層的疫病檢測(cè)。

目前，全球養(yǎng)豬業(yè)受到了Hps的嚴(yán)重威脅，建立及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是成功防治該病的關(guān)鍵。本研究建立的LAMP方法為快速鑒定Hps提供了依據(jù)。