侯敏娜,侯少平,劉艷紅,王珊,許海燕,彭修娟

(陜西國際商貿(mào)學院, 陜西 咸陽 712046)

金銀花(LoniceraJaponica)，又稱雙花、金花、銀花，為忍冬科忍冬屬忍冬組植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花[1]。具有清熱解毒、消腫止痛的功效[1]，主要用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱血毒痢、風熱感冒和溫病發(fā)熱等癥[2～4]。植物中的綠原酸具有抗菌、抗病毒等藥理活性，也是金銀花中主要成分，也是市售中成藥感冒藥中含有的成分。隨著醫(yī)學發(fā)展的研究，人們對于金銀花的理解也越來越深，對金銀花的利用程度也隨之提高。筆者研究利用微波法從金銀花中提取得到的綠原酸工藝，將為金銀花藥材合理、廣泛利用提供實驗技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花(購于河南省密縣，經(jīng)我院中藥學教研室雷國蓮教授鑒定為Lonicerajaponica)；綠原酸標準品(中國藥品生物制品檢定研究院，批號：110753-201415)；95%EtOH(天津市天力化學試劑有限公司)；NaOH(天津市河東區(qū)紅巖試劑廠)等，試劑均為市售分析純。

TU-1810型紫外-可見分光光度計(上海長城制造有限公司)；FA2004A型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；HH-2型恒溫水浴鍋(江蘇金壇市億通電子有限公司生產(chǎn))；XH-200A型微波萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；TDL-60B型高速離心機(上海安亭科學儀器廠制造)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 金銀花中綠原酸標準曲線的制作 綠原酸標準溶液的制備 將綠原酸標準品放入恒溫干燥箱中，于105℃干燥后常溫放涼以備用。準確稱取預先處理好的綠原酸標準品0.005 g，先加入少量70%的乙醇使其充分溶解，隨后再定容至刻度。分別精密移取上述配置好的標準品溶液1、2、3、4、5、6 mL，置25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，于用波長為327 nm處的紫外光光下，測各吸光度[5,6]。以吸光度A(y)和濃度C(x)在excel表格中繪作其標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，綠原酸濃度在4～24 mg·mL-1范圍內，與吸光度線性關系良好。

1.2.2 金銀花中綠原酸提取方法及含量計算 稱取100 g金銀花清洗，低溫烘干，粉碎，過二號篩，封存?zhèn)溆?。精確稱取2.000 g金銀花粉末，于100 mL燒杯中，加入適量一定濃度的乙醇，浸泡10 min，使其充分浸透后，經(jīng)微波提取后過濾，濾液定容至250 mL容量瓶中。從其中移取2 mL，定容于50 mL容量瓶中。在波長327 nm處，測其吸光度，根據(jù)公式，計算，可得綠原酸提取率(Y)[6～8]。

綠原酸提取率(Y)=CVn/1000m×100﹪

其中，C為樣品溶液濃度，mg·mL-1；V為體積，mL；n表示樣品轉為原液的倍數(shù)；m表示金銀花粉末的量，g[8]。

1.2.3 單因素考察[9～12]精確稱取金銀花粉末適量，于100 mL燒杯中，加入適量一定濃度的乙醇，浸泡10 min，使其充分浸透后，經(jīng)微波法提取。通過考察溶液的pH值(3、4、5、6、7)；乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)；料液比(1∶6 g·mL-1、1∶8 g·mL-1、1∶10 g·mL-1、1∶12 g·mL-1、1∶14 g·mL-1)和提取時間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)等因素，對金銀花中綠原酸提取率(Y)的影響。

1.2.4 響應面實驗優(yōu)化 通過單因素實驗考察結果及響應面中心組合的方法，以金銀花中綠原酸提取率為響應值(Y)，以溶液的pH值(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)和提取時間(D)為選取的對金銀花中綠原酸的提取率(Y)的影響較大的四個因素。每個因素水平分別用-1、0和1表示低、中、高三個水平，設計29組實驗。見表1。

表1 實驗因素水平

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Design- Expert8.0.6軟件分析、處理實驗數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 溶液的pH值對金銀花中綠原酸提取率的影響 由圖2可明顯看出，PH值在小于5時提取率隨著pH值升高而增加，且增加趨勢度較快，在曲線上顯示為斜率較大；但超過5以后，提取率開始逐漸減小，且pH值為5～6之間下降最大，負斜率超過了增加時的斜率。故選擇溶液的pH值等于5時，為金銀花中綠原酸提取溶液pH值的最優(yōu)取值。

2.1.2 乙醇濃度對金銀花中綠原酸提取率的影響 由圖3可明顯看出，橫坐標上乙醇濃度分數(shù)變大，金銀花中的綠原酸提取率在最初先上升隨后出現(xiàn)了下降的情況，當達到中值70%的時候，與此對應的綠原酸的提取率達到了該條件下的最大值。當高于70%時呈明顯急劇下降趨勢，可能是由于乙醇濃度高時引入的雜質比較多或抑制了一部分綠原酸的溶出。故選擇70%的乙醇，為提取金銀花中綠原酸的最優(yōu)乙醇濃度取值。

2.1.3 料液比對金銀花中綠原酸提取率的影響 由圖4可明顯看出，隨著橫坐標上料液比越來越大，金銀花中綠原酸提取率越來越高，當料液比小于1∶12 g·mL-1，提取率成正增長趨勢；當料液比大于1∶12 g·mL-1時提取率逐漸降低趨勢。故選擇料液比為1∶12 g·mL-1，為金銀花中綠原酸的最優(yōu)溶劑提取用量取值。

2.1.4 提取時間對金銀花中綠原酸提取率的影響 由圖5可明顯看出，在其他條件恒定不變的情況下，當微波時間為30 min時，提取出的金銀花綠原酸量最多，在20 min和30 min之間斜率最大，但提取時間超過30 min后，可能隨著時間的增加，綠原酸會部分分解使提取率開始逐漸減小。故選擇時間為30 min，為金銀花中綠原酸的最優(yōu)提取時間取值。

2.2 響應面法優(yōu)化實驗結果與分析

2.2.1 二次回歸模型方程的建立及方差分析 以金銀花中綠原酸提取率(Y)為考察指標，結合單因素實驗結果，對溶液pH值(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)和提取時間(D)四個因素對金銀花中綠原酸的提取率(Y)的影響，設計29組實驗，結果見表2。

表2 響應面設計實驗數(shù)據(jù)

利用Design-Expert8.0.6軟件對表2的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，得到Y(金銀花中綠原酸的提取率)與A(溶液的pH值)、B(乙醇濃度)、C(料液比)和D(提取時間)的二次多元回歸方程如下：

Y=+9.65+0.17A+0.030B-0.12C+2.979E-003D-0.18AB+0.068AC-0.083AD-0.087BC-0.039BD+0.015C D-0.19A2-0.022B2-0.12C2-0.024D2

表3 方差分析

由表3數(shù)據(jù)顯示，可以明顯看出，模型組的P值小于0.0001，說明該回歸方程有顯著性，同時R2為0.9653，說明了有96.53%的數(shù)據(jù)合理有效；F=3.16、P=0.1596，大于0.01，代表了失擬項并不顯著，說明了方程可以較好的模擬試驗內容，且變異系數(shù)遠小于10%的閾值，說明此回歸方程的精度較高。綜上所述，可以認為回歸方程合理、精確，可以用于預測金銀花中綠原酸微波提取工藝、說明實驗的可行性。

2.2.2 響應面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸分析結果，使用Design-Expert 8.0.6軟件繪制出相應的響應面圖和等高線圖，結果見圖6～圖9。

根據(jù)圖6可知，溶液的pH值和料液比都顯得很陡峭，這說明pH值和料液比的交互作用對最終結果的影響非常大。從等高線圖可知，相對來說料液比對結果的影響更大。由此，可確定溶液的pH值在5.0～5.50和料液比在1∶10～1∶14 g·mL-1范圍時，金銀花中綠原酸提取率達到了最高水平。

根據(jù)圖7的分析得出，溶液的pH值以及乙醇濃度的響應面曲線均比較尖銳，說明溶液的pH值和乙醇濃度對金銀花中綠原酸提取率影響均比較大。且乙醇濃度對其影響更大一些。由此，可確定溶液的pH值在5.0～5.50和乙醇的濃度60%～80%范圍時，金銀花中綠原酸提取率達到了最高水平。

由圖8可知，響應面曲線中溶液的pH值和提取時間都顯得很陡峭，說明溶液pH值和提取時間的交互作用對最終結果的影響非常大。由等高線圖分析，可知提取時間其影響更為明顯一些。由此，可確定溶液的pH值在5.0～5.50和提取時間在20～35 min范圍時，金銀花中綠原酸提取率達到了最高水平。

由圖9響應面圖可以明顯看出，乙醇濃度和料液比的曲面都比較陡，說明乙醇濃度和料液比對金銀花中綠原酸提取率影響均較大，且料液比的影響更為顯著一些。由此，可確定乙醇濃度在60%～80%和料液比在1∶10～1∶14 g·mL-1范圍時，金銀花中綠原酸提取率達到了最高水平。

經(jīng)求導得出最優(yōu)工藝，即溶液的pH=5.03，提取時間20 min，乙醇的濃度80%，料液比1∶10.11 g·mL-1時，金銀花中綠原酸提取率預測值為9.77285%。

2.3 工藝驗證

綜合考慮操作的可行性，在對最優(yōu)結果進行驗證時，將實驗各因素修正為：溶液的pH值=5.0，提取時間20 min，乙醇濃度80%，料液比1∶10 g·mL-1?；谛拚^的數(shù)據(jù)，開展三次平行驗證試驗。稱取2.00 g的金銀花粉末, 按照上述最優(yōu)結果進行微波輔助提取, 平行操作三次，按“1.2.2” 項下方法測定金銀花中綠原酸的提取率(結果見表4)，經(jīng)計算可得其實際得率為9.77266%，與理論值相差0.00019%，說明響應面法得出的試驗條件具有很高的可靠性。

表4 工藝驗證結果

3 結論

筆者研究了微波法提取金銀花中綠原酸工藝。通過單因素實驗考察，以金銀花中綠原酸提取率為響應值，結合響應面法四因素三水平，共設計了29組實驗。綜合考慮把修正后實驗因素，經(jīng)三次平行操作驗證，得到的最佳提取工藝參數(shù)為，即溶液的pH=5、乙醇濃度為80%，料液比為1∶10 g·mL-1，提取時間為20 min時，金銀花中綠原酸實際提取率為9.772 66%，與預測值9.772 85%，相差很小。說明該方法可行、可用于金銀花中綠原酸提取。通過筆者試驗研究可以為金銀花中藥材臨床合理、有效、廣泛利用，提供了實驗技術支持。