張弛，王惠文，崔常勇，劉丹丹，韓子逸，趙昕，劉明江,3*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2.龍口海關(guān)，山東 煙臺 265700；3.江蘇省動物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

奶牛乳房炎是困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病，目前抗生素療法仍然是該疾病的主要治療手段，但如今人類不得不面對細菌耐藥性帶來的威脅[1-2]。因此，對新型綠色抗菌劑的需求非常迫切，尤其是綠色獸用抗菌劑[3]。近年來，植物源酚類化合物因具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等多種活性吸引了研究者的廣泛關(guān)注[4-5]。阿魏酸 (ferulic acid,FA) 為酚類化合物，廣泛存在于植物細胞壁成分中[6]。連翹苷 (phillyrin,PHI) 是連翹的主要藥理成分，具有廣泛的藥理活性。已有研究指出，F(xiàn)A、PHI具有抗炎、抗菌、抗病毒等活性[7-9]，但未見FA或PHI在控制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞 (bovine mammary epithelial cells,BMEC) 炎癥反應方面的研究報道。因此，本試驗探討了FA聯(lián)合PHI對LPS誘導的BMEC炎性損傷的保護作用，為含有該類成分的中藥方劑防治大腸桿菌性奶牛乳房炎提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑：LPS(O55B5，美國Sigma公司)；DMEM-F12(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；0.25%胰酶-EDTA溶液(美國Gibco公司)；DMSO(美國Gibco公司)；Trizol(美國Invitrogen生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMEC原代培養(yǎng)

選取處于泌乳期且無隱性乳房炎的奶牛，采用外科手術(shù)方法在乳房基底部與乳頭連線中間部位釆取乳腺組織。用75%酒精沖洗乳腺組織外周1遍，然后用生理鹽水繼續(xù)沖洗干凈。將乳腺組織修剪成小塊后分離腺泡至離心管中，用含有雙抗 (200 U/mL) 的PBS清洗2～3遍，采用酶消化法得到細胞團塊后置于細胞瓶中培養(yǎng)。24 h后換液，觀察細胞生長游出情況，待大量細胞游出后可傳代培養(yǎng)。使用3～4代細胞進行相關(guān)試驗。

1.2.2 細胞活力檢測

取對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化后用完全培養(yǎng)液制備成5 × 104個/mL的細胞懸液，按200 μL/孔均勻接種于96孔板并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后棄去原培養(yǎng)基并分別添加含有不同濃度FA、PHI的基礎(chǔ)培養(yǎng)基200 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8 (CCK8) 并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，使用酶標儀 (450 nm) 檢測各孔的吸光度值，并計算細胞活力。

1.2.3 試驗分組與處理

將1 mL 細胞懸液(1 × 106個/mL)接種于6孔板內(nèi)，待細胞90%融合后，分為空白對照組(Con)、模型組(LPS)、(FA15+LPS)組、(PHI5+LPS)組、低濃度聯(lián)合用藥組(FA5+PHI5+LPS)和高濃度聯(lián)合用藥組(FA15+PHI5+LPS)。Con組基礎(chǔ)培養(yǎng)基正常培養(yǎng)12 h；模型組基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入LPS(50 μg/mL)處理12 h；FA15+LPS組使用含有FA(15 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理2 h后加入含有LPS(50 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理12 h；PHI5+LPS組使用含有PHI(5 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理2 h后加入含有LPS(50 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理12 h；低濃度聯(lián)合用藥組使用含有FA(5 μg/mL)與PHI(5 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理2 h后加入含有LPS(50 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理12 h；高濃度聯(lián)合用藥組使用含有FA(15 μg/mL)與PHI(5 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理2 h后加入含有LPS(50 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理12 h。

1.2.4 細胞內(nèi)氧自由基(ROS)的檢測

將各組細胞按照試驗要求處理后，加入胰蛋白酶消化并收集細胞，PBS洗滌2次，每組加100 μL PBS重懸細胞，并加入1 μL(10 μmol/L)ROS熒光探針(DCFH-DA)，混勻后在37 ℃避光反應30 min，PBS洗滌2次后，每組加200 μL PBS重懸細胞，及時使用流式細胞儀進行檢測。ROS水平以平均熒光強度表示。

1.2.5 細胞凋亡率的檢測

將各組細胞按照要求處理后，加入胰蛋白酶消化并收集細胞，PBS洗滌2次，按凋亡試劑盒(美國BD公司)說明書進行染色后使用流式細胞儀進行檢測[10]。

1.2.6 細胞內(nèi)炎癥因子表達的檢測

將各組細胞按照試驗要求處理后，使用Trizol分別提取各組細胞的總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物有限公司)說明書進行反轉(zhuǎn)錄后按RT-PCR試劑盒(南京諾唯贊生物有限公司)說明書操作，測定IL-1β、TNF-α、IL-6的Ct值，具體步驟參考文獻[10]。按2-ΔΔCt方法計算并分析。引物信息見表1。

表1 引物序列

1.2.7 試劑盒測定細胞內(nèi)氧化還原指標

將各組細胞按照試驗要求處理后，使用細胞裂解液提取細胞總蛋白作為待測樣品，按試劑盒(南京建成生物有限公司)說明書操作步驟測定胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度FA、PHI對BMEC活力的影響

如圖1A所示，F(xiàn)A在濃度1～60 μg/mL范圍內(nèi)對細胞活力無影響，在濃度1～30 μg/mL范圍內(nèi)有顯著促細胞增殖作用(P<0.05)。PHI在濃度1～40 μg/mL范圍內(nèi)對細胞活力無影響，在濃度1～20 μg/mL范圍內(nèi)對細胞有顯著促增殖作用(P<0.05)，見圖1B。

注:與對照(0 μg/mL)相比，*P<0.05；**P<0.01圖1 不同濃度FA(A)、PHI(B)對BMEC活力的影響

2.2 FA聯(lián)合PHI對LPS誘導BMEC內(nèi)ROS水平的影響

如圖2所示，相比Con組，LPS組ROS水平極顯著升高 (P<0.001)；FA、PHI和聯(lián)合用藥組ROS水平較LPS組均極顯著降低 (P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組的效果優(yōu)于單獨用藥組。

2.3 FA聯(lián)合PHI對LPS誘導BMEC凋亡的影響

如圖3所示，LPS組較Con組細胞凋亡率極顯著升高 (P<0.001)；FA、PHI和聯(lián)合用藥組細胞凋亡率較LPS組均極顯著降低 (P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組的效果優(yōu)于單獨用藥組。

2.4 FA聯(lián)合PHI對LPS誘導BMEC炎性因子表達的影響

與Con組相比，LPS組細胞內(nèi)炎性因子IL-1β(圖4A)、IL-6(圖4B)、TNF-α(圖4C)表達極顯著升高 (P<0.001)；FA、PHI和聯(lián)合用藥組IL-1β、IL-6、TNF-α含量較LPS組均極顯著降低 (P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組的效果優(yōu)于單獨用藥組。

注：***P<0.001與Con組相比；與LPS組相比，##P<0.01，###P<0.001。下同圖2 FA聯(lián)合PHI對LPS誘導BMEC內(nèi)ROS水平的影響

A.流式細胞儀檢測；B.細胞凋亡率分析圖3 FA聯(lián)合PHI對LPS誘導BMEC凋亡的影響

A.IL-1β；B.IL-6；C.TNF-α圖4 FA聯(lián)合PHI對LPS誘導BMEC內(nèi)炎性因子表達的影響

2.5 FA聯(lián)合PHI對LPS誘導BMEC內(nèi)SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

相比Con組，LPS組細胞內(nèi)SOD(圖5A)、GSH-Px(圖5B)活性極顯著降低，MDA含量(圖5C)極顯著升高 (P<0.001)，F(xiàn)A、PHI和聯(lián)合用藥組細胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性均顯著升高 (P<0.05)，MDA含量均極顯著降低 (P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組的效果優(yōu)于單獨用藥組。

注：與LPS組相比，#P<0.05圖5 FA聯(lián)合PHI對LPS誘導BMEC SOD(A)、GSH-Px(B)活性和MDA含量(C)的影響

3 討論

BMEC是抵御病原微生物的第一道防線，細胞間的緊密連接是維持血液和牛奶之間成分交換的重要結(jié)構(gòu)[11]。BMEC損傷和不受控制的“血-乳”成分交換引起的“炎癥風暴”是導致乳腺功能異常和產(chǎn)奶量下降的關(guān)鍵因素[12]。大腸桿菌是奶牛乳房炎的常見致病菌之一，常誘導急性、劇烈的炎癥反應并導致乳腺明顯紅腫、疼痛及產(chǎn)奶量急劇下降等臨床癥狀[13-14]。前期研究表明，LPS能夠誘導BMEC劇烈的炎癥、氧化應激反應并導致細胞損傷、凋亡[15]。本文對FA聯(lián)合PHI對LPS誘導的BMEC炎性損傷的保護作用進行了研究。

研究顯示，F(xiàn)A、PHI對BMEC具有較廣泛的細胞安全濃度范圍，且具有顯著的促細胞增殖作用，因此，選擇15 μg/mL、5 μg/mL的FA和5 μg/mL的PHI研究二者對LPS誘導的BMEC炎性損傷的協(xié)同保護作用。LPS誘導BMEC胞內(nèi)ROS含量和細胞凋亡率顯著升高，與前期研究相符；而FA、PHI單獨用藥組和聯(lián)合用藥組均可顯著降低LPS誘導的細胞內(nèi)ROS水平和細胞凋亡率，且聯(lián)合用藥的效果更優(yōu)。說明FA聯(lián)合PHI對LPS誘導的BMEC氧化應激損傷具有保護作用。

炎癥與氧化應激密不可分[16-17]。通過對LPS誘導的細胞內(nèi)炎癥因子、氧化還原指標的檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A、PHI和聯(lián)合用藥組均顯著降低LPS誘導的IL-1β、IL-6、TNF-α的表達；顯著提高過氧化物分解酶 (SOD、GSH-Px) 的活性，減少氧化產(chǎn)物 (MDA) 的含量，且聯(lián)合用藥的效果更優(yōu)。說明FA聯(lián)合PHI可明顯抑制LPS誘導的BEMC炎癥、氧化應激反應，從而維持細胞活性。研究表明，F(xiàn)A、PHI對LPS誘導的BMEC炎性損傷具有協(xié)同保護作用，但具體的分子機制需進一步的研究。

LPS可誘導BMEC產(chǎn)生大量的炎癥因子、ROS，并進一步誘導外周血中吞噬細胞(中性粒細胞、巨噬細胞)迅速活化并大量遷移至乳腺組織，通過“呼吸爆發(fā)”作用殺滅病原菌；但不受控制的炎癥、氧化應激反應將導致“血乳”屏障破壞、乳腺組織損傷[18]。因此，F(xiàn)A、PHI通過抑制LPS誘導的BMEC炎癥、氧化應激反應，不僅保護了BMEC的結(jié)構(gòu)、功能，同時可減弱對外周血吞噬細胞的趨化作用，避免過度炎癥、氧化應激反應的發(fā)生。本研究為含有該類成分的中藥或中藥制劑防治大腸桿菌性奶牛乳房炎提供了一定的理論依據(jù)。