孫雨，宋曉暉，魏巍，李碩，馬英，李曉霞，畢一鳴，汪葆玥，王傳彬，楊林

(中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600)

當(dāng)前我國(guó)各級(jí)動(dòng)物疫病的防控與凈化領(lǐng)域，尤其是邊境動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)防控領(lǐng)域還存在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)不能互聯(lián)互通、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)落后、原始數(shù)據(jù)記錄處理重復(fù)滯后、工作效率低、檢測(cè)數(shù)據(jù)不能實(shí)時(shí)分析、監(jiān)測(cè)預(yù)警不及時(shí)、應(yīng)急處置協(xié)調(diào)復(fù)雜困難等向題，給跨境動(dòng)物疫病防控帶來(lái)了極大的困難。邊境動(dòng)物疫病的監(jiān)測(cè)機(jī)制落后，也嚴(yán)重威脅了國(guó)內(nèi)畜牧業(yè)的產(chǎn)業(yè)安全。因此，加快推進(jìn)動(dòng)物疫病防控系統(tǒng)的疫病現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)與溯源云平臺(tái)、互聯(lián)網(wǎng)+、物聯(lián)網(wǎng)、大數(shù)據(jù)處理、人工智能等相結(jié)合探索建立的動(dòng)物疫病現(xiàn)場(chǎng)快速診斷檢測(cè)與遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)云平臺(tái)等新新型模式，完善各級(jí)動(dòng)物疫病防控機(jī)制建設(shè)，改進(jìn)跨境動(dòng)物疫情監(jiān)測(cè)技術(shù)是當(dāng)前疫控信息化的當(dāng)務(wù)之急。因此以建設(shè)形成全覆蓋全利用的“大系統(tǒng)、大平臺(tái)、大數(shù)據(jù)”為目標(biāo)，接入數(shù)據(jù)共享平臺(tái)，形成物理分散、邏輯集中、數(shù)據(jù)互通、資源共享的檢測(cè)云平臺(tái)管理系統(tǒng)是當(dāng)前動(dòng)物疫病防控凈化與監(jiān)測(cè)信息化建設(shè)的發(fā)展方向和應(yīng)用趨勢(shì)[1-4]。課題組按照跨境動(dòng)物疫病防控機(jī)制建設(shè)項(xiàng)目要求，在廣西、云南邊境地區(qū)開展了布魯氏菌病、豬瘟、口蹄疫等主要?jiǎng)游镆卟〉牟蓸颖O(jiān)測(cè)，以及遠(yuǎn)程診斷監(jiān)測(cè)預(yù)警平臺(tái)在邊境地區(qū)的應(yīng)用，并對(duì)相應(yīng)的疫病跨境傳入傳播風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了分析，以期改變當(dāng)前邊境動(dòng)物疫病防控凈化過(guò)程中傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)效率較低、檢測(cè)后數(shù)據(jù)處理繁瑣、人工成本較高、不能實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)快速診斷等問(wèn)題，為創(chuàng)新我國(guó)動(dòng)物疫病防控凈化新型監(jiān)測(cè)模式提供借鑒，同時(shí)也期望通過(guò)上述措施的施行，為我國(guó)跨境動(dòng)物疫病防控凈化提供強(qiáng)而有力的支撐。

1 材料與方法

1.1 被檢血清

1 328份豬血清、821份牛血清現(xiàn)場(chǎng)采集自云南瑞麗-緬甸邊境，廣西龍州-越南等邊境地區(qū)的規(guī)模場(chǎng)、種畜場(chǎng)、屠宰場(chǎng)以及散養(yǎng)戶，共涉及52個(gè)場(chǎng)點(diǎn)。

1.2 現(xiàn)場(chǎng)快速診斷檢測(cè)試劑

豬瘟病毒熒光微球抗體快速檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20190721)、布魯菌病熒光微球抗體快速檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20190522)、口蹄疫病毒3ABC熒光微球抗體快速檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20190517)，均購(gòu)于洛陽(yáng)現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司。國(guó)外比對(duì)試劑盒：口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA試劑盒購(gòu)自于美國(guó)IDEXX公司(批號(hào)99-41379)；豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于法國(guó)IDVET公司(批號(hào)M331)；布魯菌病抗體ELISA試劑盒購(gòu)自于美國(guó)碩騰公司(批號(hào)18ZEAJ008)。

1.3 現(xiàn)場(chǎng)快速診斷檢測(cè)方法的樣本要求

樣本采集應(yīng)避免交叉污染，所采集樣本應(yīng)當(dāng)天進(jìn)行處理；血清：按常規(guī)方法抽取2～3 mL血液置潔凈干燥的試管中，靜置約1 h待血液凝固后于4 000 r/min離心10 min(也可將血液樣本靜置約2 h，待血液凝固自然析出血清)，分離血清。要求血清清亮，無(wú)溶血、無(wú)污染。血清樣本短期可于2～8℃保存，長(zhǎng)期需置-20℃保存。

1.4 現(xiàn)場(chǎng)快速診斷檢測(cè)方法的檢測(cè)步驟

樣本的離心管稀釋：將檢測(cè)樣本在1.5 mL離心管中做10倍稀釋并混勻(例如野外操作時(shí)用吸管取9滴樣本稀釋液+1滴樣本)；樣本的稀釋板稀釋：將檢測(cè)樣本在稀釋板上做10倍稀釋并混勻(例如：20μL樣本+180μL樣本稀釋液)；撕開檢測(cè)試紙鋁箔包裝袋，取出檢測(cè)試紙，放于平整、潔凈的臺(tái)面上；用配套吸管吸取已稀釋好的樣本，垂直而緩慢的滴加2-3滴(約80μL)到加樣孔內(nèi)；室溫下放置15 min，讀數(shù)前先將產(chǎn)品配套ID卡插入便攜式熒光免疫分析儀，之后將反應(yīng)到時(shí)間的檢測(cè)試紙加樣孔朝里插入便攜式熒光免疫分析儀，點(diǎn)擊“快速檢測(cè)”進(jìn)行讀數(shù)，超過(guò)25 min的結(jié)果無(wú)效。

1.5 結(jié)果判定

當(dāng)檢測(cè)值<0.1時(shí)，判為陰性；當(dāng)檢測(cè)值≥0.1時(shí)，判為陽(yáng)性。

1.6 遠(yuǎn)程診斷監(jiān)測(cè)預(yù)警平臺(tái)的對(duì)接快檢設(shè)備與平臺(tái)的運(yùn)行流程

便攜式微型熒光檢測(cè)儀、現(xiàn)場(chǎng)快速診斷檢測(cè)試劑盒與溯源云平臺(tái)實(shí)時(shí)對(duì)接構(gòu)成了動(dòng)物疫病現(xiàn)場(chǎng)快速診斷檢測(cè)與遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)云平臺(tái)的工作模式流程。其中遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)溯源云平臺(tái)的對(duì)接快檢設(shè)備—超微型熒光檢測(cè)儀的特點(diǎn)具有便攜式、操作簡(jiǎn)單、藍(lán)牙無(wú)線通訊、PC/APP軟件通用等特征。主要技術(shù)指標(biāo)可以控制在檢測(cè)精密性≤1.5%、檢測(cè)時(shí)間≤5 s、檢測(cè)線性范圍寬可達(dá)4個(gè)數(shù)量級(jí)、自動(dòng)處理數(shù)據(jù)并保存上傳云平臺(tái)。數(shù)據(jù)上傳后，溯源云平臺(tái)自動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)大數(shù)據(jù)分析，并在主控平臺(tái)實(shí)時(shí)展示相應(yīng)監(jiān)測(cè)時(shí)間、監(jiān)測(cè)地理位置、監(jiān)測(cè)病種陽(yáng)性率以及疫病傳入風(fēng)險(xiǎn)因素分析等，完全實(shí)現(xiàn)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)的人工智能分析。

2 結(jié)果

2.1 口蹄疫3ABC血清抗體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)

對(duì)821份牛血清樣品和1 328份豬血清樣品分別進(jìn)行了口蹄疫3ABC抗體的檢測(cè)。從口蹄疫3ABC抗體檢出率來(lái)看，共檢出?？谔阋?ABC抗體陽(yáng)性樣品143份，陽(yáng)性率為17.4%；檢出豬口蹄疫3ABC抗體陽(yáng)性樣品127份，陽(yáng)性率為9.6%。本次監(jiān)測(cè)調(diào)查所有境內(nèi)動(dòng)物均免疫過(guò)口蹄疫疫苗，境外走私販賣動(dòng)物口蹄疫疫苗免疫背景情況不明。

2.2 豬瘟病毒血清抗體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)

對(duì)1 328份豬的血清樣品份進(jìn)行了豬瘟病毒抗體的檢測(cè)。從豬瘟病毒抗體檢出率來(lái)看，共檢出了豬瘟病毒血清抗體陽(yáng)性樣品705份。由于目前豬瘟疫苗是選擇性免疫，部分養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖場(chǎng)開展了免疫工作，而部分場(chǎng)選擇了對(duì)該病的凈化措施，在豬瘟病毒抗體檢測(cè)方面，有53.1%的動(dòng)物體內(nèi)抗體為陽(yáng)性。但是不排除部分邊境動(dòng)物體內(nèi)豬瘟病毒野毒感染導(dǎo)致血清抗體陽(yáng)性結(jié)果。

2.3 布魯菌病血清抗體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)

對(duì)821份牛血清樣品進(jìn)行了布魯菌病抗體的檢測(cè)。從布魯菌病抗體檢出率來(lái)看，共檢出牛布魯菌病抗體陽(yáng)性樣品17份，陽(yáng)性率為2.1%。本次監(jiān)測(cè)調(diào)查的養(yǎng)殖牛場(chǎng)均未免疫疫苗。因此監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示邊境部分動(dòng)物體內(nèi)存在布魯菌病感染導(dǎo)致血清抗體陽(yáng)性的結(jié)果，尤其走私入境牛血清抗體陽(yáng)性率占比較高。

2.4 遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)溯源云平臺(tái)與快檢設(shè)備的對(duì)接以及數(shù)據(jù)的上傳分析

將便攜式微型熒光檢測(cè)儀的檢測(cè)結(jié)果實(shí)時(shí)對(duì)接上傳至遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)溯源云平臺(tái)。動(dòng)物疫病現(xiàn)場(chǎng)快速診斷檢測(cè)與遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)云平臺(tái)主要構(gòu)架分為4個(gè)功能模塊，分別為檢測(cè)管理模塊、數(shù)據(jù)字典模塊、統(tǒng)計(jì)分析模塊及平臺(tái)管理模塊。遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)溯源云平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化、多維度分析，數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)讀取等功能。在后臺(tái)管理方面，可實(shí)現(xiàn)功能模塊化、數(shù)據(jù)列表展現(xiàn)、數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)讀取展現(xiàn)等功能，較好地實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物疫病現(xiàn)場(chǎng)快速診斷檢測(cè)與遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)功能模式。

2.5 口蹄疫病毒3ABC抗體現(xiàn)場(chǎng)快速診斷試劑盒的檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

從采集的豬和牛血清中抽取300份樣本，其中150份牛血清樣本，150份豬血清樣本，使用口蹄疫病毒3ABC抗體現(xiàn)場(chǎng)快速診斷試劑盒檢測(cè)，結(jié)果與美國(guó)IDEXX公司的口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，兩種方法的總符合率為92.33%，陽(yáng)性符合率為91.91%，陰性符合率為92.68%。

2.6 豬瘟病毒抗體現(xiàn)場(chǎng)快速診斷試劑盒的檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

從采集的豬血清中抽取300份樣本，使用豬瘟病毒抗體現(xiàn)場(chǎng)快速診斷試劑盒檢測(cè)，結(jié)果與法國(guó)IDVET公司豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，兩種方法的總符合率為93%，陽(yáng)性符合率為92%，陰性符合率為94%。

表2 口蹄疫病毒3ABC抗體現(xiàn)場(chǎng)快速診斷試劑盒的檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

表3 豬瘟病毒抗體現(xiàn)場(chǎng)快速診斷試劑盒的檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

2.7 布魯氏菌病抗體現(xiàn)場(chǎng)快速診斷試劑盒的檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

牛血清樣本300份，其中陰性與陽(yáng)性樣本各150份，使用布魯氏菌病抗體現(xiàn)場(chǎng)快速診斷試劑盒檢測(cè)，結(jié)果與美國(guó)碩騰公司的布魯氏菌病抗體間接ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，兩種方法的總符合率為96%，陽(yáng)性符合率為97.33%，陰性符合率為94.67%。

表4 布魯氏菌病抗體現(xiàn)場(chǎng)快速診斷試劑盒的檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

3 討論

境外動(dòng)物攜帶病原復(fù)雜，免疫覆蓋率低，走私動(dòng)物入境前往往途經(jīng)多個(gè)國(guó)家，體況及免疫力差，容易攜帶病毒，造成疫情。同時(shí)，走私進(jìn)境動(dòng)物從境外不斷輸入口蹄疫病毒新毒株，造成我國(guó)口蹄疫病毒優(yōu)勢(shì)毒株和流行范圍不斷變化。2018年8月，非洲豬瘟傳入我國(guó)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成極大損失；塞內(nèi)卡病毒于近年傳入我國(guó)，迅速蔓延至多個(gè)省份；口蹄疫病毒新毒株Ind2001等經(jīng)邊境走私動(dòng)物流動(dòng)傳入我國(guó)，目前已成為主要流行毒株，造成多起疫情[5-9]；小反芻獸疫與布魯菌病的邊境防控壓力巨大[10-14]，因此加大對(duì)邊境地區(qū)動(dòng)物疫病的監(jiān)測(cè)力度，以大量、可靠的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)為依托，建立遠(yuǎn)程動(dòng)物疫病預(yù)警預(yù)報(bào)體系勢(shì)在必行。經(jīng)過(guò)多年的工作積累，課題組在動(dòng)物疫病防控凈化推進(jìn)，遠(yuǎn)程凈化診斷檢測(cè)平臺(tái)創(chuàng)新試點(diǎn)工作過(guò)程中取得了重要進(jìn)展與突破。本研究開發(fā)的遠(yuǎn)程診斷監(jiān)測(cè)平臺(tái)以開發(fā)的檢測(cè)新技術(shù)-熒光微球快速檢測(cè)方法為依托，利用熒光微球快速檢測(cè)儀器內(nèi)的物聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)卡與實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)預(yù)警平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)接，已經(jīng)做到了現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)與遠(yuǎn)程大數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)預(yù)警分析種畜禽場(chǎng)內(nèi)采集的動(dòng)物樣品疫病流行情況。同時(shí)通過(guò)GPS地理定位系統(tǒng)，實(shí)時(shí)上傳預(yù)警平臺(tái)監(jiān)測(cè)的地理數(shù)據(jù)等信息，然后通過(guò)預(yù)警平臺(tái)實(shí)時(shí)大數(shù)據(jù)展示分析(分析檢測(cè)時(shí)間、地理位置、動(dòng)物畜種、樣品抗體陽(yáng)性情況等)，在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析動(dòng)物疫病傳入的風(fēng)險(xiǎn)。目前課題組初步建立了口蹄疫、小反芻獸疫、豬瘟、藍(lán)耳病、布魯菌病、禽白血病等重大跨境動(dòng)物疫病的現(xiàn)場(chǎng)在線檢測(cè)與遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)預(yù)警防控工作模式，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)預(yù)警上述重大動(dòng)物疫病傳入試點(diǎn)種畜禽場(chǎng)的風(fēng)險(xiǎn)與流行規(guī)律，開啟了我國(guó)跨境地區(qū)的種畜禽場(chǎng)動(dòng)物疫情監(jiān)測(cè)新模式，為我國(guó)邊境地區(qū)的種畜禽場(chǎng)動(dòng)物疫病防控凈化機(jī)制建設(shè)提供數(shù)據(jù)支持與技術(shù)支撐。后期課題組計(jì)劃補(bǔ)充完善現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)平臺(tái)中的的重要疫病的凈化檢測(cè)項(xiàng)目，完善種畜禽場(chǎng)凈化所需的重要?jiǎng)游镆卟‖F(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)與實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)預(yù)警體系。著重提高云平臺(tái)的遠(yuǎn)程、同步、共享檢測(cè)數(shù)據(jù)；實(shí)現(xiàn)動(dòng)物疫病檢測(cè)實(shí)現(xiàn)科學(xué)化、標(biāo)準(zhǔn)化管理；為動(dòng)物疫病科學(xué)研究提供重要依據(jù)。

本研究使用跨境動(dòng)物疫病風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)預(yù)警新模式—遠(yuǎn)程診斷監(jiān)測(cè)預(yù)警平臺(tái)對(duì)云南瑞麗-緬甸邊境，廣西龍州-越南邊境等地區(qū)的規(guī)模場(chǎng)、種畜場(chǎng)、屠宰場(chǎng)以及散養(yǎng)戶的1 328份豬血清樣品和821份牛血清樣品進(jìn)行了跨境動(dòng)物疫病的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷與遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)預(yù)警的試點(diǎn)應(yīng)用。通過(guò)本次試點(diǎn)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，邊境地區(qū)部分動(dòng)物體內(nèi)能檢測(cè)出豬瘟、口蹄疫以及布魯菌病的陽(yáng)性抗體。本次監(jiān)測(cè)豬瘟抗體陽(yáng)性率為53.1%，豬口蹄疫3ABC抗體陽(yáng)性率為9.6%，?？谔阋?ABC陽(yáng)性率17.4%，布魯菌病陽(yáng)性率達(dá)到2.1%。導(dǎo)致豬和牛體內(nèi)口蹄疫病毒3ABC抗體陽(yáng)性檢出率較高的原因可能與不同養(yǎng)殖場(chǎng)所使用的免疫疫苗純度不同有關(guān)?？谔阋咭呙缂兌炔桓咄ǔ?huì)導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)3ABC抗體的上升，干擾鑒別野毒感染抗體與疫苗免疫抗體。因此后期還需要結(jié)合分子病原學(xué)方法來(lái)鑒別檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的野毒感染抗原和疫苗免疫抗原。同時(shí)建議養(yǎng)殖廠使用純化工藝較好的疫苗，降低動(dòng)物體內(nèi)3ABC抗體的產(chǎn)生，較少鑒別野毒感染抗體與疫苗免疫抗體的干擾因素。由于目前豬瘟疫苗是選擇性免疫，部分養(yǎng)殖場(chǎng)選擇了該病的凈化措施，在豬瘟病毒抗體檢測(cè)方面，有53.1%的動(dòng)物體內(nèi)抗體為陽(yáng)性。但是不排除部分邊境動(dòng)物體內(nèi)豬瘟病毒野毒感染導(dǎo)致血清抗體陽(yáng)性結(jié)果，所以這些陽(yáng)性場(chǎng)急需開展豬瘟凈化工作。雖然廣西與云南地區(qū)為非布魯菌病國(guó)家強(qiáng)制免疫地區(qū)，但是本次監(jiān)測(cè)調(diào)查的部分場(chǎng)點(diǎn)仍有動(dòng)物體內(nèi)布魯菌病抗體為陽(yáng)性，說(shuō)明有部分邊境養(yǎng)殖場(chǎng)存在布魯菌感染，急需對(duì)這些場(chǎng)的動(dòng)物開展布病凈化剔除工作。在現(xiàn)場(chǎng)快速診斷試劑盒與國(guó)外檢測(cè)試劑盒的敏感性、特異性結(jié)果比對(duì)方面，本次試點(diǎn)應(yīng)用的豬瘟等主要?jiǎng)游镆卟〉目焖僭\斷檢測(cè)方法與國(guó)外主流檢測(cè)試劑盒相比，均具有較好的敏感性與特異性符合率，完全可以應(yīng)用于豬瘟病毒抗體、口蹄疫病毒3ABC抗體、布魯菌病抗體等的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)工作中。

在邊境動(dòng)物疫病防控建議方面，跨境傳播動(dòng)物疫病對(duì)我國(guó)疫病防控的影響持續(xù)增大。建議加大對(duì)邊境地區(qū)動(dòng)物疫病的監(jiān)測(cè)力度，以大量、可靠的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)為依托，建立跨境動(dòng)物疫病預(yù)警預(yù)報(bào)體系。同時(shí)建立有效的聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制，跨境動(dòng)物疫病傳入風(fēng)險(xiǎn)大，途徑多，危害面廣，防控難度大，涉及到多個(gè)部門，沒(méi)有良好的頂層設(shè)計(jì)和分工協(xié)作機(jī)制，跨境動(dòng)物疫病的傳入風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、風(fēng)險(xiǎn)管控很難實(shí)現(xiàn)。建議進(jìn)一步健全多部門協(xié)作機(jī)制，切實(shí)形成有效的跨境動(dòng)物疫病防控體系，構(gòu)建跨境動(dòng)物疫病嚴(yán)密的防線。