孫雨，宋曉暉，魏巍，李碩，馬英，李曉霞，畢一鳴，汪葆玥，王傳彬，楊林

(中國動物疫病預防控制中心，北京 102600)

當前我國各級動物疫病的防控與凈化領域，尤其是邊境動物疫病監(jiān)測防控領域還存在實驗室檢測數(shù)據(jù)不能互聯(lián)互通、現(xiàn)場快速檢測技術落后、原始數(shù)據(jù)記錄處理重復滯后、工作效率低、檢測數(shù)據(jù)不能實時分析、監(jiān)測預警不及時、應急處置協(xié)調(diào)復雜困難等向題，給跨境動物疫病防控帶來了極大的困難。邊境動物疫病的監(jiān)測機制落后，也嚴重威脅了國內(nèi)畜牧業(yè)的產(chǎn)業(yè)安全。因此，加快推進動物疫病防控系統(tǒng)的疫病現(xiàn)場快速檢測與溯源云平臺、互聯(lián)網(wǎng)+、物聯(lián)網(wǎng)、大數(shù)據(jù)處理、人工智能等相結合探索建立的動物疫病現(xiàn)場快速診斷檢測與遠程監(jiān)測云平臺等新新型模式，完善各級動物疫病防控機制建設，改進跨境動物疫情監(jiān)測技術是當前疫控信息化的當務之急。因此以建設形成全覆蓋全利用的“大系統(tǒng)、大平臺、大數(shù)據(jù)”為目標，接入數(shù)據(jù)共享平臺，形成物理分散、邏輯集中、數(shù)據(jù)互通、資源共享的檢測云平臺管理系統(tǒng)是當前動物疫病防控凈化與監(jiān)測信息化建設的發(fā)展方向和應用趨勢[1-4]。課題組按照跨境動物疫病防控機制建設項目要求，在廣西、云南邊境地區(qū)開展了布魯氏菌病、豬瘟、口蹄疫等主要動物疫病的采樣監(jiān)測，以及遠程診斷監(jiān)測預警平臺在邊境地區(qū)的應用，并對相應的疫病跨境傳入傳播風險進行了分析，以期改變當前邊境動物疫病防控凈化過程中傳統(tǒng)的實驗室檢測效率較低、檢測后數(shù)據(jù)處理繁瑣、人工成本較高、不能實時現(xiàn)場快速診斷等問題，為創(chuàng)新我國動物疫病防控凈化新型監(jiān)測模式提供借鑒，同時也期望通過上述措施的施行，為我國跨境動物疫病防控凈化提供強而有力的支撐。

1 材料與方法

1.1 被檢血清

1 328份豬血清、821份牛血清現(xiàn)場采集自云南瑞麗-緬甸邊境，廣西龍州-越南等邊境地區(qū)的規(guī)模場、種畜場、屠宰場以及散養(yǎng)戶，共涉及52個場點。

1.2 現(xiàn)場快速診斷檢測試劑

豬瘟病毒熒光微球抗體快速檢測試劑盒(批號20190721)、布魯菌病熒光微球抗體快速檢測試劑盒(批號20190522)、口蹄疫病毒3ABC熒光微球抗體快速檢測試劑盒(批號20190517)，均購于洛陽現(xiàn)代生物技術研究院有限公司。國外比對試劑盒：口蹄疫非結構蛋白抗體ELISA試劑盒購自于美國IDEXX公司(批號99-41379)；豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒購自于法國IDVET公司(批號M331)；布魯菌病抗體ELISA試劑盒購自于美國碩騰公司(批號18ZEAJ008)。

1.3 現(xiàn)場快速診斷檢測方法的樣本要求

樣本采集應避免交叉污染，所采集樣本應當天進行處理；血清：按常規(guī)方法抽取2～3 mL血液置潔凈干燥的試管中，靜置約1 h待血液凝固后于4 000 r/min離心10 min(也可將血液樣本靜置約2 h，待血液凝固自然析出血清)，分離血清。要求血清清亮，無溶血、無污染。血清樣本短期可于2～8℃保存，長期需置-20℃保存。

1.4 現(xiàn)場快速診斷檢測方法的檢測步驟

樣本的離心管稀釋：將檢測樣本在1.5 mL離心管中做10倍稀釋并混勻(例如野外操作時用吸管取9滴樣本稀釋液+1滴樣本)；樣本的稀釋板稀釋：將檢測樣本在稀釋板上做10倍稀釋并混勻(例如：20μL樣本+180μL樣本稀釋液)；撕開檢測試紙鋁箔包裝袋，取出檢測試紙，放于平整、潔凈的臺面上；用配套吸管吸取已稀釋好的樣本，垂直而緩慢的滴加2-3滴(約80μL)到加樣孔內(nèi)；室溫下放置15 min，讀數(shù)前先將產(chǎn)品配套ID卡插入便攜式熒光免疫分析儀，之后將反應到時間的檢測試紙加樣孔朝里插入便攜式熒光免疫分析儀，點擊“快速檢測”進行讀數(shù)，超過25 min的結果無效。

1.5 結果判定

當檢測值<0.1時，判為陰性；當檢測值≥0.1時，判為陽性。

1.6 遠程診斷監(jiān)測預警平臺的對接快檢設備與平臺的運行流程

便攜式微型熒光檢測儀、現(xiàn)場快速診斷檢測試劑盒與溯源云平臺實時對接構成了動物疫病現(xiàn)場快速診斷檢測與遠程監(jiān)測云平臺的工作模式流程。其中遠程監(jiān)測溯源云平臺的對接快檢設備—超微型熒光檢測儀的特點具有便攜式、操作簡單、藍牙無線通訊、PC/APP軟件通用等特征。主要技術指標可以控制在檢測精密性≤1.5%、檢測時間≤5 s、檢測線性范圍寬可達4個數(shù)量級、自動處理數(shù)據(jù)并保存上傳云平臺。數(shù)據(jù)上傳后，溯源云平臺自動進行監(jiān)測大數(shù)據(jù)分析，并在主控平臺實時展示相應監(jiān)測時間、監(jiān)測地理位置、監(jiān)測病種陽性率以及疫病傳入風險因素分析等，完全實現(xiàn)動物疫病監(jiān)測的人工智能分析。

2 結果

2.1 口蹄疫3ABC血清抗體的現(xiàn)場快速檢測

對821份牛血清樣品和1 328份豬血清樣品分別進行了口蹄疫3ABC抗體的檢測。從口蹄疫3ABC抗體檢出率來看，共檢出?？谔阋?ABC抗體陽性樣品143份，陽性率為17.4%；檢出豬口蹄疫3ABC抗體陽性樣品127份，陽性率為9.6%。本次監(jiān)測調(diào)查所有境內(nèi)動物均免疫過口蹄疫疫苗，境外走私販賣動物口蹄疫疫苗免疫背景情況不明。

2.2 豬瘟病毒血清抗體的現(xiàn)場快速檢測

對1 328份豬的血清樣品份進行了豬瘟病毒抗體的檢測。從豬瘟病毒抗體檢出率來看，共檢出了豬瘟病毒血清抗體陽性樣品705份。由于目前豬瘟疫苗是選擇性免疫，部分養(yǎng)殖場養(yǎng)殖場開展了免疫工作，而部分場選擇了對該病的凈化措施，在豬瘟病毒抗體檢測方面，有53.1%的動物體內(nèi)抗體為陽性。但是不排除部分邊境動物體內(nèi)豬瘟病毒野毒感染導致血清抗體陽性結果。

2.3 布魯菌病血清抗體的現(xiàn)場快速檢測

對821份牛血清樣品進行了布魯菌病抗體的檢測。從布魯菌病抗體檢出率來看，共檢出牛布魯菌病抗體陽性樣品17份，陽性率為2.1%。本次監(jiān)測調(diào)查的養(yǎng)殖牛場均未免疫疫苗。因此監(jiān)測結果顯示邊境部分動物體內(nèi)存在布魯菌病感染導致血清抗體陽性的結果，尤其走私入境牛血清抗體陽性率占比較高。

2.4 遠程監(jiān)測溯源云平臺與快檢設備的對接以及數(shù)據(jù)的上傳分析

將便攜式微型熒光檢測儀的檢測結果實時對接上傳至遠程監(jiān)測溯源云平臺。動物疫病現(xiàn)場快速診斷檢測與遠程監(jiān)測云平臺主要構架分為4個功能模塊，分別為檢測管理模塊、數(shù)據(jù)字典模塊、統(tǒng)計分析模塊及平臺管理模塊。遠程監(jiān)測溯源云平臺可實現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化、多維度分析，數(shù)據(jù)實時讀取等功能。在后臺管理方面，可實現(xiàn)功能模塊化、數(shù)據(jù)列表展現(xiàn)、數(shù)據(jù)實時讀取展現(xiàn)等功能，較好地實現(xiàn)了動物疫病現(xiàn)場快速診斷檢測與遠程監(jiān)測功能模式。

2.5 口蹄疫病毒3ABC抗體現(xiàn)場快速診斷試劑盒的檢測比對結果

從采集的豬和牛血清中抽取300份樣本，其中150份牛血清樣本，150份豬血清樣本，使用口蹄疫病毒3ABC抗體現(xiàn)場快速診斷試劑盒檢測，結果與美國IDEXX公司的口蹄疫非結構蛋白抗體ELISA試劑盒檢測結果進行比對。結果顯示，兩種方法的總符合率為92.33%，陽性符合率為91.91%，陰性符合率為92.68%。

2.6 豬瘟病毒抗體現(xiàn)場快速診斷試劑盒的檢測比對結果

從采集的豬血清中抽取300份樣本，使用豬瘟病毒抗體現(xiàn)場快速診斷試劑盒檢測，結果與法國IDVET公司豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒檢測結果進行比對。結果顯示，兩種方法的總符合率為93%，陽性符合率為92%，陰性符合率為94%。

表2 口蹄疫病毒3ABC抗體現(xiàn)場快速診斷試劑盒的檢測比對結果

表3 豬瘟病毒抗體現(xiàn)場快速診斷試劑盒的檢測比對結果

2.7 布魯氏菌病抗體現(xiàn)場快速診斷試劑盒的檢測比對結果

牛血清樣本300份，其中陰性與陽性樣本各150份，使用布魯氏菌病抗體現(xiàn)場快速診斷試劑盒檢測，結果與美國碩騰公司的布魯氏菌病抗體間接ELISA試劑盒檢測結果進行比對。結果顯示，兩種方法的總符合率為96%，陽性符合率為97.33%，陰性符合率為94.67%。

表4 布魯氏菌病抗體現(xiàn)場快速診斷試劑盒的檢測比對結果

3 討論

境外動物攜帶病原復雜，免疫覆蓋率低，走私動物入境前往往途經(jīng)多個國家，體況及免疫力差，容易攜帶病毒，造成疫情。同時，走私進境動物從境外不斷輸入口蹄疫病毒新毒株，造成我國口蹄疫病毒優(yōu)勢毒株和流行范圍不斷變化。2018年8月，非洲豬瘟傳入我國，對養(yǎng)豬業(yè)造成極大損失；塞內(nèi)卡病毒于近年傳入我國，迅速蔓延至多個省份；口蹄疫病毒新毒株Ind2001等經(jīng)邊境走私動物流動傳入我國，目前已成為主要流行毒株，造成多起疫情[5-9]；小反芻獸疫與布魯菌病的邊境防控壓力巨大[10-14]，因此加大對邊境地區(qū)動物疫病的監(jiān)測力度，以大量、可靠的監(jiān)測數(shù)據(jù)為依托，建立遠程動物疫病預警預報體系勢在必行。經(jīng)過多年的工作積累，課題組在動物疫病防控凈化推進，遠程凈化診斷檢測平臺創(chuàng)新試點工作過程中取得了重要進展與突破。本研究開發(fā)的遠程診斷監(jiān)測平臺以開發(fā)的檢測新技術-熒光微球快速檢測方法為依托，利用熒光微球快速檢測儀器內(nèi)的物聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)卡與實時在線監(jiān)測預警平臺進行數(shù)據(jù)對接，已經(jīng)做到了現(xiàn)場實時快速檢測與遠程大數(shù)據(jù)監(jiān)測預警分析種畜禽場內(nèi)采集的動物樣品疫病流行情況。同時通過GPS地理定位系統(tǒng)，實時上傳預警平臺監(jiān)測的地理數(shù)據(jù)等信息，然后通過預警平臺實時大數(shù)據(jù)展示分析(分析檢測時間、地理位置、動物畜種、樣品抗體陽性情況等)，在線實時監(jiān)測分析動物疫病傳入的風險。目前課題組初步建立了口蹄疫、小反芻獸疫、豬瘟、藍耳病、布魯菌病、禽白血病等重大跨境動物疫病的現(xiàn)場在線檢測與遠程監(jiān)測預警防控工作模式，實時監(jiān)測預警上述重大動物疫病傳入試點種畜禽場的風險與流行規(guī)律，開啟了我國跨境地區(qū)的種畜禽場動物疫情監(jiān)測新模式，為我國邊境地區(qū)的種畜禽場動物疫病防控凈化機制建設提供數(shù)據(jù)支持與技術支撐。后期課題組計劃補充完善現(xiàn)場檢測、遠程監(jiān)測平臺中的的重要疫病的凈化檢測項目，完善種畜禽場凈化所需的重要動物疫病現(xiàn)場快速檢測與實時在線監(jiān)測預警體系。著重提高云平臺的遠程、同步、共享檢測數(shù)據(jù)；實現(xiàn)動物疫病檢測實現(xiàn)科學化、標準化管理；為動物疫病科學研究提供重要依據(jù)。

本研究使用跨境動物疫病風險監(jiān)測預警新模式—遠程診斷監(jiān)測預警平臺對云南瑞麗-緬甸邊境，廣西龍州-越南邊境等地區(qū)的規(guī)模場、種畜場、屠宰場以及散養(yǎng)戶的1 328份豬血清樣品和821份牛血清樣品進行了跨境動物疫病的現(xiàn)場快速診斷與遠程監(jiān)測預警的試點應用。通過本次試點監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，邊境地區(qū)部分動物體內(nèi)能檢測出豬瘟、口蹄疫以及布魯菌病的陽性抗體。本次監(jiān)測豬瘟抗體陽性率為53.1%，豬口蹄疫3ABC抗體陽性率為9.6%，牛口蹄疫3ABC陽性率17.4%，布魯菌病陽性率達到2.1%。導致豬和牛體內(nèi)口蹄疫病毒3ABC抗體陽性檢出率較高的原因可能與不同養(yǎng)殖場所使用的免疫疫苗純度不同有關?？谔阋咭呙缂兌炔桓咄ǔе聞游矬w內(nèi)3ABC抗體的上升，干擾鑒別野毒感染抗體與疫苗免疫抗體。因此后期還需要結合分子病原學方法來鑒別檢測動物體內(nèi)的野毒感染抗原和疫苗免疫抗原。同時建議養(yǎng)殖廠使用純化工藝較好的疫苗，降低動物體內(nèi)3ABC抗體的產(chǎn)生，較少鑒別野毒感染抗體與疫苗免疫抗體的干擾因素。由于目前豬瘟疫苗是選擇性免疫，部分養(yǎng)殖場選擇了該病的凈化措施，在豬瘟病毒抗體檢測方面，有53.1%的動物體內(nèi)抗體為陽性。但是不排除部分邊境動物體內(nèi)豬瘟病毒野毒感染導致血清抗體陽性結果，所以這些陽性場急需開展豬瘟凈化工作。雖然廣西與云南地區(qū)為非布魯菌病國家強制免疫地區(qū)，但是本次監(jiān)測調(diào)查的部分場點仍有動物體內(nèi)布魯菌病抗體為陽性，說明有部分邊境養(yǎng)殖場存在布魯菌感染，急需對這些場的動物開展布病凈化剔除工作。在現(xiàn)場快速診斷試劑盒與國外檢測試劑盒的敏感性、特異性結果比對方面，本次試點應用的豬瘟等主要動物疫病的快速診斷檢測方法與國外主流檢測試劑盒相比，均具有較好的敏感性與特異性符合率，完全可以應用于豬瘟病毒抗體、口蹄疫病毒3ABC抗體、布魯菌病抗體等的現(xiàn)場快速檢測工作中。

在邊境動物疫病防控建議方面，跨境傳播動物疫病對我國疫病防控的影響持續(xù)增大。建議加大對邊境地區(qū)動物疫病的監(jiān)測力度，以大量、可靠的監(jiān)測數(shù)據(jù)為依托，建立跨境動物疫病預警預報體系。同時建立有效的聯(lián)防聯(lián)控機制，跨境動物疫病傳入風險大，途徑多，危害面廣，防控難度大，涉及到多個部門，沒有良好的頂層設計和分工協(xié)作機制，跨境動物疫病的傳入風險預警、風險管控很難實現(xiàn)。建議進一步健全多部門協(xié)作機制，切實形成有效的跨境動物疫病防控體系，構建跨境動物疫病嚴密的防線。