曲雅新，孫連靜，張勝斌，王若木，楊春杰，鐘蓮，周學(xué)光，黃克宏，羅期方，陳櫻，韋祖樟，黃偉堅(jiān)，歐陽(yáng)康*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)西江有限公司，廣西 貴港 537104)

豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PRoV)、豬札幌病毒(porcine Sapovirus，PoSaV)、豬星狀病毒(porcine astrovirus，PAstV)是嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖業(yè)的腸道病原，臨床上常以腹瀉、嘔吐和厭食為特征[1-4]。豬輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)，豬的A群PRoV是引起新生仔豬和斷奶仔豬急性腹瀉的常見(jiàn)病原體[5-7]，此病毒在豬場(chǎng)中陽(yáng)性感染率為3.30%～67.30%[2]；豬星狀病毒為星狀病毒科(Astroviridae)成員，該病毒可感染各年齡段的豬[8-9]。2010年蘭家暖等[10]曾對(duì)廣西及廣東腹瀉豬糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬星狀病毒陽(yáng)性率高達(dá)82.8%。豬札幌病毒是杯狀病毒科(Caliciviridae)、札幌樣病毒屬成員，該病毒在全世界流行，斷奶仔豬感染率最高且常呈混合感染，此病毒具有復(fù)雜的遺傳多樣性[11-13]。沈權(quán)[14]曾發(fā)現(xiàn)一株豬源毒株與人源毒株高度同源；陳琰[15]、Saif等[16]曾在糞便中發(fā)現(xiàn)札幌病毒、輪狀病毒和星狀病毒的混合感染。

豬群感染PRoV、PoSaV、PAstV后，其臨床癥狀及病理變化相似，臨床上難以區(qū)分，必須依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)才能進(jìn)行鑒別診斷，給豬群腹瀉疾病的防控帶來(lái)較大困難。目前常用的診斷方法有電鏡觀(guān)察、病毒的分離、血清學(xué)方法等，但是這些方法存在操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，多重PCR檢測(cè)方法因檢測(cè)成本低廉、效率高、耗時(shí)短等被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的檢測(cè)，另外，多重PCR檢測(cè)方法更適用于臨床混合感染的檢測(cè)。本研究旨在建立快速、準(zhǔn)確鑒別PRoV、PoSaV和PAstV臨床感染的檢測(cè)方法，為豬群腹瀉疾病的監(jiān)測(cè)和防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與臨床病料樣品

豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、PRoV、PAstV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)均由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，PoSaV陽(yáng)性材料為本實(shí)驗(yàn)室保存臨床病料，豬瘟病毒(CSFV)陽(yáng)性材料為本實(shí)驗(yàn)室所購(gòu)疫苗。試驗(yàn)所用的80份臨床樣品為腸內(nèi)容物，采自于2018年6月至2019年5月廣西、廣東以及云南等地發(fā)生腹瀉的規(guī)模豬場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒、2×TaqPlus Master Mix Ⅱ、DL1 000 DNA Marker購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD18-T載體、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank上發(fā)表的PRoV毒株(登錄號(hào):MF940551.1)、PoSaV毒株(登錄號(hào)：KX688107)、PAstV毒株(登錄號(hào)：KF787112.2)基因序列，在基因保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，應(yīng)用Oligo 6.0軟件對(duì)所選區(qū)域進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)出3對(duì)特異性引物(表1)，分別用于PRoV VP6基因、PoSaV RdRp基因、PAstV ORF1基因的擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段分別為160、299和466 bp。引物序列由生物公司上海杰李合成。

表1 引物信息

1.2.2 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

樣品經(jīng)12 000 r/min 4 ℃ 離心5 min后，取上清按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提病毒總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單重PCR擴(kuò)增

以PRoV、PoSaV和PAstV的cDNA為模板，利用本研究設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行單重PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：2×TaqPlus Master Mix Ⅱ 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板3μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s、51℃ 30 s、72℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將得到的目的片段進(jìn)行純化并連接到pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒p-PRoV，p-PoSaV和p-PAstV，將陽(yáng)性質(zhì)粒送至上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 三重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)已建立好的單重PCR反應(yīng)體系，對(duì)退火溫度(48 ℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃、53 ℃)進(jìn)行優(yōu)化；將引物終濃度稀釋至0.125、0.250、0.375、0.500、0.625和0.750 pmol/μL，進(jìn)行組合，篩選出最佳引物濃度；并對(duì)反應(yīng)循環(huán)數(shù)(25、30、35、40、45)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 特異性試驗(yàn)

以PRoV、PoSaV、PAstV、PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV的cDNA和PRV、PCV2的DNA為模板，在已建立的三重PCR反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，分析三重PCR的特異性。

1.2.6 敏感性試驗(yàn)

測(cè)定3種重組質(zhì)粒的濃度并計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)，將重組質(zhì)粒等比例混合后，以10倍系列稀釋至108～100拷貝數(shù)/μL，應(yīng)用已建立的三重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，分析三重PCR的敏感性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

以PRoV、PoSaV、PAstV的cDNA為模板，應(yīng)用已建立的三重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，共重復(fù)6次，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，驗(yàn)證本研究建立的三重PCR的重復(fù)性。

1.2.8 臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用本研究建立的三重PCR檢測(cè)方法和單重PCR方法對(duì)所采集的80份腹瀉樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提病毒總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，將陽(yáng)性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 單重PCR擴(kuò)增

以PRoV、PoSaV和PAstV的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為160、299和466 bp的目的片段(圖1)，將擴(kuò)增的目的片段純化后連接到pMD18-T載體，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序序列與NCBI上公布的參考株序列比對(duì)，確認(rèn)質(zhì)粒上連接的片段為本研究擴(kuò)增的目的片段。

M.DL1 000 Marker；1.目的基因片段；2.陰性對(duì)照；A.PRoV VP6基因片段；B.PoSaV RdRp基因片段;C.PAstV ORF1基因片段圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1 三重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)反應(yīng)退火溫度、引物濃度以及反應(yīng)循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定反應(yīng)最佳退火溫度為50 ℃(圖2)；PoSaV、PAstV的最佳引物濃度為0.125 pmol/μL，PRoV的最佳引物濃度為0.750 pmol/μL(圖3)；反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)為35(圖4)。

M.DL1 000 Marker；1～6.退火溫度分別為：48 ℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃、53 ℃圖2 三重PCR退火溫度優(yōu)化

M.DL1 000 Marker；1～6.PoSaV、PAstV的引物終濃度為0.125 pmol/μL，PRoV的引物終濃度分別為0.750、0.625、0.500、0.375、0.250和0.125 pmol/μL圖3 引物濃度優(yōu)化

M.DL1 000 Marker；1～5.循環(huán)數(shù)分別為25、30、35、40、45圖4 循環(huán)數(shù)優(yōu)化

2.2 特異性試驗(yàn)

用PRoV、PoSaV、PAstV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV的cDNA和PRV、PCV2的DNA為模板，在已建立的三重PCR反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR(圖5)，結(jié)果顯示，PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明三重PCR的特異性良好。

M.DL1 000 Marker；1.三重混合質(zhì)粒；2.PRoV；3.PoSaV；4.PAstV；5～10.分別為CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、PRV、PCV2；11.陰性對(duì)照?qǐng)D5 三重PCR特異性試驗(yàn)

2.3 敏感性試驗(yàn)

測(cè)定3種重組質(zhì)粒p-PRoV、p-PoSaV、p-PAstV的濃度并將質(zhì)粒10倍系列進(jìn)行稀釋至108～100拷貝數(shù)/μL，用所建立的三重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)(圖6)，結(jié)果顯示，PRoV的最低檢測(cè)限量為1.38×102拷貝數(shù)/μL；PoSaV的最低檢測(cè)限量為8.33×102拷貝數(shù)/μL；PAstV的最低檢測(cè)限量為4.40×103拷貝數(shù)/μL。三重PCR具有較好的敏感性。

M.DL1 000 Marker；1-9.重組質(zhì)粒濃度分別為108～100 拷貝數(shù)/μL；10.陰性對(duì)照?qǐng)D6 三重PCR敏感性試驗(yàn)

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

用PRoV、PoSaV、PAstV的cDNA為模板，在已建立的三重PCR反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR(圖7)，共重復(fù)6次，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，結(jié)果顯示，PRoV、PoSaV、PAstV三重PCR具有較好的重復(fù)性。

M.DL1 000 Marker；1～6.PRoV+PoSaV+PAstV；7.陰性對(duì)照?qǐng)D7 三重PCR重復(fù)性試驗(yàn)

2.5 三重PCR檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用

應(yīng)用本研究建立的三重PCR檢測(cè)方法對(duì)2018—2019年廣西、廣東以及云南等地規(guī)模豬場(chǎng)采集的80份臨床腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PRoV、PoSaV及PAstV陽(yáng)性樣品均為4份，樣品陽(yáng)性率均為5.00%，其中有1份樣品存在PRoV與PoSaV的混合感染，1份樣品存在PAstV與PoSaV的混合感染，部分樣品電泳圖見(jiàn)圖8。將單重PCR方法與本研究建立的三重PCR方法相對(duì)比，結(jié)果顯示，2種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，陽(yáng)性樣品符合率為100%。陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，其結(jié)果相一致。

M.DL1 000 Marker；1.三重混合質(zhì)粒；2～7.臨床樣品；8.陰性對(duì)照?qǐng)D8 三重PCR臨床樣品檢測(cè)

3 討論

近年來(lái)，在規(guī)模化豬場(chǎng)中因多種病毒混合感染引起豬腹瀉的報(bào)道日益增多，嚴(yán)重危害生豬的養(yǎng)殖。由于PRoV、PoSaV和PAstV這3種病毒所引起的臨床癥狀和病理變化相似很難區(qū)分，給疾病的診斷造成了不小的挑戰(zhàn)，故需一種方法能夠快速對(duì)其進(jìn)行鑒別。多重PCR不僅克服了電鏡觀(guān)察、病毒分離、免疫組織化學(xué)、血清學(xué)等診斷技術(shù)操作復(fù)雜、準(zhǔn)確率較低、耗時(shí)長(zhǎng)等[17-18]缺點(diǎn)，且檢測(cè)成本低廉、耗時(shí)短、效率高，故建立一種能夠同時(shí)、快速檢測(cè)出這3種病毒的檢測(cè)方法在臨床診斷和病原監(jiān)測(cè)方面具有重要意義。目前，已報(bào)道有李軍等[19]建立了TGEV、PEDV、PRoVA的多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法；羅欣[20]建立了諾如病毒GⅠ型和GⅡ型、腺病毒、星狀病毒和札如病毒的五重PCR檢測(cè)方法；楊文宇等[17]建立了PRoVA、PRoVC、PAstV三重PCR檢測(cè)方法，但尚未有報(bào)道可同時(shí)鑒別PRoV、PoSaV和PAstV的檢測(cè)方法。因此，本研究在3種病毒保守區(qū)設(shè)計(jì)引物建立一種特異、有效、敏感的鑒別診斷方法，為PRoV、PoSaV和PAstV的快速鑒別診斷以及流行病學(xué)調(diào)查提供幫助。

應(yīng)用所建立的方法對(duì)2018年6月至2019年5月采自廣西、廣東、云南的80份臨床腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：各病毒感染率均為5%，輪狀病毒檢測(cè)結(jié)果與使用陳靜[21]所設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)結(jié)果一致，豬星狀病毒檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率略高于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果；同時(shí)試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在這80份臨床腹瀉樣品中存在1例豬札幌病毒與豬輪狀病毒以及1例豬札幌病毒與豬星狀病毒的雙重感染。對(duì)于病毒的混合感染，陸琰[15]、Saif等[16]使用免疫電鏡法在腹瀉仔豬的糞便中首次觀(guān)察到豬札幌病毒，同時(shí)在該糞便中發(fā)現(xiàn)輪狀病毒和星狀病毒；Shimizu等[22]提出星狀病毒在世界各國(guó)的豬群中普遍存在，發(fā)生單一病毒感染的情況很少見(jiàn)，這與本次試驗(yàn)所發(fā)現(xiàn)病毒存在混合感染的現(xiàn)象相似。在一定程度上提示生豬養(yǎng)殖時(shí)要加強(qiáng)多病原的預(yù)防。

有研究表明，豬源星狀病毒有感染人類(lèi)或其他物種的可能性[23]。已有文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)自動(dòng)物的星狀病毒和人源星狀病毒之間的重組事件[24]；豬源札幌病毒與人源札幌病毒具有較高同源性[25-27]，且已分離到由人源和豬源札幌病毒之間通過(guò)基因重組產(chǎn)生的新毒株[28-30]，這提示札幌病毒可能具有在人與動(dòng)物之間跨種傳播的能力。同樣輪狀病毒在嬰兒和其他哺乳動(dòng)物中廣泛存在，也是引起新生仔豬和斷奶仔豬急性腹瀉最常見(jiàn)的因素，易繼發(fā)細(xì)菌感染[7]。

綜上所述，本研究建立的豬輪狀病毒、豬札幌病毒和豬星狀病毒三重PCR檢測(cè)方法不僅為豬場(chǎng)腹瀉病的監(jiān)測(cè)和防控提供技術(shù)支持，更是對(duì)潛在人畜共患病的監(jiān)測(cè)具有公共衛(wèi)生意義。