周祖陽，張輝，張清陽，白瑩，楊俊琦，劉薦男，李凱揚(yáng)，劉玉芳*

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056001；2.河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056001；3.北京市畜牧總站，北京 100107)

地方雞品種與商業(yè)化蛋雞品種相比，盡管雞蛋具有蛋黃顏色深、口感好等特點，但因其產(chǎn)蛋量低而嚴(yán)重制約了地方雞品種的推廣和發(fā)展[1]。蛋雞的產(chǎn)蛋性能受到多個基因的調(diào)控，查閱前人研究發(fā)現(xiàn)，血管活性腸肽受體-1(vasoactive intestinal peptide receptor-1，VIPR-1)是VIP蛋白受體家族成員之一，屬于Ⅱ類亞家族。有文獻(xiàn)報道，VIPR-1基因在下丘腦和垂體中均有表達(dá)，但主要在垂體中表達(dá)，并且只有垂體中VIPR-1基因的mRNA差異表達(dá)與生殖功能改變相關(guān)，VIPR-1基因已被證實參與禽類的育雛調(diào)節(jié)[2]。與其他家族成員結(jié)構(gòu)相似，VIPR-1是一種糖蛋白，具有大的親水性細(xì)胞外N端和7個高度保守的疏水性跨膜螺旋以及細(xì)胞質(zhì)C端[3]。辛清武等[4-5]研究發(fā)現(xiàn)VIPR-1基因C902T突變和A988G突變與黑番鴨的就巢性狀顯著相關(guān)，能夠一定程度上提高黑番鴨的產(chǎn)蛋性能。在雌性鵪鶉的研究中發(fā)現(xiàn)，VIPR-1基因的G373T和A313G兩個突變位點可用于選擇產(chǎn)蛋量高或蛋重大的鵪鶉品系，此外，VIPR-1基因還可以作為分子標(biāo)記輔助鵪鶉生長性狀選擇的遺傳標(biāo)記[6]。在寧都三黃雞的研究中也發(fā)現(xiàn)，VIPR-1基因中的C1704887T和C175301T兩個突變位點可能是家禽高產(chǎn)蛋量的重要分子標(biāo)記[7]。位于VIPR-1基因內(nèi)含子6的C1704887T與雞300日齡的產(chǎn)蛋數(shù)有顯著相關(guān)，基于VIPR-1基因C1704887T和C175301T的單倍型分析也證實了這一結(jié)果[8]。另一研究分析了VIPR-1基因的突變位點A1661691G與蛋雞初產(chǎn)日齡相關(guān)[9]。這些研究表明，VIPR-1基因的分子生物學(xué)功能與家禽產(chǎn)蛋性狀密切相關(guān)，而太行雞VIPR-1基因與產(chǎn)蛋性能的研究較少。

本研究選擇高產(chǎn)組和低產(chǎn)組太行雞卵巢組織作為研究對象，經(jīng)過PCR擴(kuò)增、克隆VIPR-1基因序列并進(jìn)行測序和結(jié)構(gòu)分析，利用半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)探討VIPR-1在太行雞260日齡產(chǎn)蛋階段的表達(dá)情況，為后期進(jìn)一步探究VIPR-1基因的分子生物學(xué)功能及深入研究VIPR-1基因與蛋雞產(chǎn)蛋性能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取260日齡健康、產(chǎn)蛋穩(wěn)定、羽色良好、體重相近的太行雞母雞250只進(jìn)行標(biāo)號，從蛋雞開產(chǎn)日開始，每日下午3時記錄每只母雞的產(chǎn)蛋情況，統(tǒng)計產(chǎn)蛋雞260日齡內(nèi)的產(chǎn)蛋量，將雞群分為高產(chǎn)(H)(產(chǎn)蛋量≥40枚，平均產(chǎn)蛋量(48.33±0.40)枚)和低產(chǎn)(L)(產(chǎn)蛋量<40枚，平均產(chǎn)蛋量(28.12±0.40)枚兩組，隨后進(jìn)行翅靜脈采集血液樣本并注明標(biāo)號，-20 ℃保存。從高、低產(chǎn)蛋組中選取體態(tài)均勻、健康母雞各10只，屠宰后快速采集心、肝、脾、肺、腎、卵巢組織等樣品，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 太行雞血樣DNA提取

取20 μL血樣，使用血液DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)進(jìn)行DNA提取。取出2 μL DNA與上樣Buffer混勻，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。利用NanoDrop 2 000檢測DNA的濃度，隨后放入低溫-20 ℃保存。

1.2.2 各組織RNA提取與cDNA合成

分別取約100 mg 心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和卵巢組織，按照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和RNA濃度檢測。檢測合格的RNA樣品，根據(jù)Fast Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒(北京天根生物科技有限公司)說明書將太行雞各組織RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 太行雞VIPR-1基因克隆、擴(kuò)增與測序

在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到雞參考基因組中VIPR-1基因的CDS區(qū)序列(GenBank登錄號：NM_001097523.1)，利用Primer premier 5軟件設(shè)計目的基因(VIPR-1-E1、VIPR-1-E2、VIPR-1-E3、VIPR-1-E4、VIPR-1-E5-6、VIPR-1-E7-8、VIPR-1-E9、VIPR-1-E10、VIPR-1-E11、VIPR-1-E12、VIPR-1-E13)的CDS區(qū)引物，引物信息見表1。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TaqPCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度見下表30 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

表1 擴(kuò)增VIPR-1基因CDS區(qū)及實時熒光定量PCR引物

1.2.4 太行雞VIPR-1序列結(jié)構(gòu)分析

測得VIPR-1基因CDS區(qū)結(jié)果利用 NCBI 網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上BLASTP軟件進(jìn)行同源基因的氨基酸序列搜索；開放閱讀框(open reading frame,ORF)氨基酸序列分析用NCBI中的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)工具完成。利用ExPASy網(wǎng)站(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)分析蛋白的理化性質(zhì)包括相對分子質(zhì)量、等電點、消光系數(shù)、親水性和疏水性、氨基酸組成等；SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將獲得的序列在DNAMAN 5.0軟件上進(jìn)行分析，并與GenBank上獲取的其它物種序列進(jìn)行同源性比較。利用 MEGA X軟件以距離矩陣鄰近歸并法(NeighborJoining，NJ)建種間系統(tǒng)發(fā)生樹，通過 bootstrap 法獲得系統(tǒng)分支的置信度(重復(fù)次數(shù)為1 000)。

1.2.6VIPR-1組織表達(dá)譜分析

以心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢組織的cDNA為模板，VIPR-1-Q1-F/R(見表1)為引物，GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行半定量RT-PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×TaqPCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共31個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析半定量RT-PCR結(jié)果。

1.2.7 實時熒光定量PCR分析

我想，我們的暗戀大多無果而終，是因為自己不夠優(yōu)秀吧。“我不想繼續(xù)開小賣部了，我要奮斗！”沐子她從小賣部撤了資，藏起浮躁的女漢子性格，不再成天把八卦和大話掛在嘴邊，虔誠地皺著眉頭聽老師講課，活得像一個“出家人”，靈臺一片澄澈空明。

以高、低產(chǎn)太行雞卵巢組織cDNA為模板(每組10只)，VIPR-1-Q1-F/R(見表1)為引物，GAPDH為內(nèi)參基因，采用SYBR Green Ⅰ染料法，進(jìn)行實時熒光定量PCR，對VIPR-1基因在太行雞高、低產(chǎn)蛋量個體卵巢組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。反應(yīng)體系：Real MasterMix(SYBR Green I)10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量，利用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件的t檢驗進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 太行雞VIPR-1基因PCR擴(kuò)增

DNA提取后，經(jīng)核酸檢測儀檢測和瓊脂糖電泳合格后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用VIPR-1-E1、VIPR-1-E2、VIPR-1-E3、VIPR-1-E4、VIPR-1-E5-6、VIPR-1-E7-8、VIPR-1-E9、VIPR-1-E10、VIPR-1-E11、VIPR-1-E12和VIPR-1-E13共11對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(每對引物4個梯度)，將產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)電泳，分別可見目的片段大小的特異性條帶(圖1)，隨后送去測序，獲得序列進(jìn)行比對拼接，用于后續(xù)基因結(jié)構(gòu)分析。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 太行雞VIPR-1基因序列分析

克隆測序后獲得5 942 bp全長的太行雞VIPR-1基因cDNA序列，此序列包含了長度為1 341 bp的ORF(開放閱讀框)，編碼446個氨基酸。將該序列與參考基因組的VIPR-1基因完整CDS序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其同源性為100%，推定該序列即為太行雞VIPR-1基因的完整CDS序列。

M.DL5000 DNA marker；a.泳道1～4、5～8、9～12、13～16分別代表VIPR-1-E1、VIPR-1-E2、VIPR-1-E3、VIPR-1-E4在4個梯度下的PCR產(chǎn)物電泳；b.泳道1～4代表VIPR-1-E5-6在4個梯度下的PCR產(chǎn)物電泳；c.泳道1～4、5～8、9～12、13～16、17～20、21～24分別代表VIPR-1-E7-8、VIPR-1-E9、VIPR-1-E10、VIPR-1-E11、VIPR-1-E12和VIPR-1-E13在4個梯度下的PCR產(chǎn)物電泳圖1 VIPR-1基因梯度PCR產(chǎn)物電泳

2.2.2 分子進(jìn)化分析

用DNAMAN 5.0 軟件進(jìn)行同源性比較分析，太行雞VIPR-1基因編碼區(qū)序列和其他已經(jīng)報道的禽類VIPR-1基因的同源性較高，其中與野鴨(XM_005023238)的同源性最高為 92.24%；其次為火雞(U31991)90.11%；與綿羊(XM_027958056)、豬(NM_214036)、牛(NM_001081607)、人(NM_004624)、小鼠(NM_011703)、兔(XM_002713061)、非洲爪蟾(XM_002941864)、沼澤蛙(AF100644)等哺乳物種、兩棲類的同源性較低，在64.51%～67.18%。氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，太行雞的VIPR-1氨基酸序列與野鴨氨基酸一致性高達(dá)93.72%，與火雞的一致性也達(dá)到82.93%，與人、犬、牛、豬等哺乳物種的同源性在62.95%～65.50%，與非洲爪蟾、兩棲類沼澤蛙的同源性比其他哺乳物種高，分別為74.22%和76.34%。見表2。

表2 VIPR-1不同物種間同源性比較

2.2.3 N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 太行雞VIPR-1基因系統(tǒng)發(fā)生樹

2.2.4 太行雞VIPR-1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ORF Finder預(yù)測太行雞VIPR-1基因編碼446個氨基酸。太行雞VIPR-1蛋白特征分析顯示，該蛋白分子質(zhì)量為112 620.03 Da，理論等電點為4.98，280 nm的摩爾消光系數(shù)為172 375 moL中含量-1；該蛋白質(zhì)包含了20 種常見的氨基酸，其氨基酸含量中色氨酸最低為1.9%，亮氨酸和絲氨酸含量高分別為10.9%和10.6%，其他氨基酸的含量在2.0～8.0之間，酸性氨基酸和堿性氨基酸含量較低，分別為7.1%和16.6%，帶電荷的氨基酸和疏水氨基酸的含量分別為21%和36%；精氨酸(Arg)疏水性最強(qiáng)(最高分值為4.5)，異亮氨酸(Ile)親水性最強(qiáng)(最低分值為-4.5)；疏水性預(yù)測顯示太行雞 VIPR-1大多數(shù)氨基酸為親水性氨基酸，總平均疏水性為-0.250(圖3)。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)太行雞VIPR-1蛋白由α-螺旋、延伸、β-旋折疊及無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)組成，所占比例分別為30.1%、21.12%、7.85%和40.94%。

圖3 太行雞VIPR-1蛋白疏水性分析

2.3 組織半定量RT-PCR表達(dá)譜分析

VIPR-1基因在太行雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和卵巢中均表達(dá)，但在卵巢中表達(dá)量最高(圖4)。

1.心臟；2.肝臟；3.脾臟；4.肺臟；5.腎臟；6.卵巢圖4 VIPR-1基因在太行雞各組織中表達(dá)

2.4 熒光定量PCR分析卵巢中VIPR-1基因表達(dá)水平

VIPR-1基因在高產(chǎn)母雞和低產(chǎn)母雞卵巢中相對表達(dá)量見圖5。熒光定量PCR結(jié)果顯示，VIPR-1基因在高產(chǎn)太行雞卵巢組織中的表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)蛋雞中的表達(dá)量(P<0.05)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)；H.太行雞高產(chǎn)組；L.太行雞低產(chǎn)組圖5 VIPR-1基因在太行雞高產(chǎn)和低產(chǎn)母雞卵巢中的表達(dá)量

3 討論

太行雞又稱河北柴雞，主要分布于河北省境內(nèi)太行山區(qū)及周邊地區(qū)，中心產(chǎn)區(qū)為沙河、贊皇、淶源等地，以產(chǎn)蛋為主，兼作肉用。太行雞具有體型小、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、覓食力強(qiáng)、蛋肉品質(zhì)好，營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，但該地方雞品種同時也存在著產(chǎn)蛋期產(chǎn)蛋量低的缺點[10]。本研究分析了對太行雞血液中VIPR-1基因編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)一步對不同物種的VIPR-1基因CDS序列及氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，利用定量和半定量PCR技術(shù)對VIPR-1基因在太行雞中的表達(dá)模式進(jìn)行研究，為深入探究VIPR-1基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

近年來，大量研究對禽類VIPR-1基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了VIPR-1基因在不同繁殖時期mRNA的表達(dá)量不同，證明了VIPR-1基因?qū)Ξa(chǎn)蛋性能有一定影響[11-12]。在洪軍等[13]的研究中，以如皋黃雞為素材，發(fā)現(xiàn)VIPR-1基因內(nèi)含子2的2個多態(tài)位點與如皋黃雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)VIPR-1基因?qū)θ绺撄S雞的產(chǎn)蛋性能和雞蛋品質(zhì)有一定影響。目前，在家禽的研究中，雞、黑番鴨、鵪鶉等物種的VIPR-1基因CDS序列已被克隆[2,4,6]，然而在太行雞中對于該基因的研究目前少有報道，本試驗獲得了太行雞VIPR-1基因CDS全長，并對該基因的核酸序列和蛋白序列的分子特性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)太行雞與野鴨VIPR-1基因一致性高達(dá)92.24%，其次是火雞90.11%，表明該基因的功能在禽類中具有一定的保守性，推測其在功能上可能也具有一致性。

前人研究發(fā)現(xiàn)，VIPR-1基因在家禽馴化和飼養(yǎng)期間的改良中經(jīng)受了較強(qiáng)的選擇壓力，其DNA序列突變與雞的繁殖有關(guān)[14]。VIPR-1基因在家禽行為中起著重要的作用，VIPR-1基因的mRNA表達(dá)在不同的時期不盡相同[15]。Karacay等[16]研究發(fā)現(xiàn)，VIPR-1基因主要是通過與VIP蛋白特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)PRL合成與分泌，進(jìn)而影響畜禽的繁殖性能。朱志明等[17]研究發(fā)現(xiàn)VIPR-1基因的多個多態(tài)位點對蛋雞產(chǎn)蛋性狀存在顯著影響，可以作為影響產(chǎn)蛋性狀的重要分子標(biāo)記。本試驗發(fā)現(xiàn)VIPR-1基因在不同的組織均有表達(dá)，在卵巢組織中表達(dá)量最高；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)VIPR-1基因在太行雞高產(chǎn)組卵巢組織中的表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)組，該結(jié)論驗證了前人結(jié)果，同時也表明該基因能夠影響太行雞的產(chǎn)蛋性能。

4 結(jié)論

太行雞VIPR-1基因作為影響蛋雞產(chǎn)蛋性能的重要候選基因，在其他家禽如火雞、野鴨中具有較高的相似性；該基因在卵巢組織中高表達(dá)且在高產(chǎn)組中的表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)組，因此，該基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異與太行雞產(chǎn)蛋性能密切相關(guān)。本研究為進(jìn)一步探究VIPR-1基因的分子作用機(jī)制和在太行雞產(chǎn)蛋性能中的調(diào)控作用提供了依據(jù)，為后期深入研究蛋雞產(chǎn)蛋性能的分子生物學(xué)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。