韓國(guó)波，李英花，葉孟傲然，許永男,2*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.吉林省延邊黃牛種質(zhì)資源保護(hù)工程研究中心，吉林 延吉 133000)

卵母細(xì)胞的成熟是指卵母細(xì)胞在受到多種因素的影響下其活性得以激活，完成第一次減數(shù)分裂進(jìn)入到第二次減數(shù)分裂中期的過(guò)程，其中生發(fā)泡破裂(GVBD)是減數(shù)分裂恢復(fù)的標(biāo)志。卵母細(xì)胞開(kāi)始減數(shù)分裂前的停滯和從MI到MII是其減數(shù)分裂的兩個(gè)非常重要的時(shí)期,也是阻礙其成熟的兩個(gè)主要原因[1-2]。Chk1是細(xì)胞周期中的一套保證DNA復(fù)制和染色體分配質(zhì)量的檢查機(jī)制，是一類負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞周期進(jìn)程中出現(xiàn)異常事件，如DNA損傷或DNA復(fù)制受阻時(shí)，這類調(diào)節(jié)機(jī)制就被激活，及時(shí)地中斷細(xì)胞周期的運(yùn)行，待細(xì)胞修復(fù)或排除故障后，細(xì)胞周期才能恢復(fù)運(yùn)轉(zhuǎn)[3-4]。研究Chk1在豬卵母細(xì)胞中的表達(dá)和定位及其對(duì)豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的影響，對(duì)于改善豬卵母細(xì)胞體外成熟具有重要意義。

有研究表明，Chk1對(duì)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂前的停滯是必需的，消耗Chk1會(huì)加速小鼠卵母細(xì)胞的GVBD，其過(guò)表達(dá)會(huì)使小鼠卵母細(xì)胞紡錘體組裝檢查點(diǎn)(SAC)活化，并阻礙卵母細(xì)胞的成熟[5]；而豬卵母細(xì)胞的成熟不需要Chk1，但Chk1的敲低會(huì)延緩卵母細(xì)胞的成熟，并對(duì)染色體的排列有影響[6]。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的重新開(kāi)始與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)的活動(dòng)密切相關(guān)，Chk1可抑制細(xì)胞周期調(diào)控因子Cdc25，使CDK1和CDK2失活，DNA不能被復(fù)制；此外，它有助于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Wee1/Myt1)的磷酸化，使Wee1/Myt1更穩(wěn)定[7-8]。Chk1也在SAC調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，在有絲分裂中SAC通過(guò)延緩姐妹染色單體分離，直到所有姐妹染色單體的著絲粒與兩極的紡錘絲相連接，來(lái)防止染色體的異常分離[9]。停在減數(shù)分裂初期的卵母細(xì)胞，其CDK1的活性由幾個(gè)因素調(diào)節(jié)而維持在較低程度。細(xì)胞周期蛋白B(Cyclin B)是CDK1相關(guān)蛋白，通過(guò)去磷酸化來(lái)激活CDK1；Cdc25磷酸酶在哺乳動(dòng)物中包括Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C，負(fù)責(zé)CDK1的Thr14、Tyr15位點(diǎn)的去磷酸化來(lái)激活CDK1；Wee1/Myt1激酶家族通過(guò)磷酸化CDK1的Thr14和Tyr15位點(diǎn)負(fù)調(diào)控CDK1；Gwl激酶通過(guò)與ENSA/ARPP19相互作用抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)的激活，PP2A可負(fù)調(diào)節(jié)CDK1的活化。在G2中，由于CDK1在Thr14和Tyr15被Wee1/Myt1激酶家族磷酸化，因此，卵母細(xì)胞促成熟因子(MPF)被抑制，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入M期時(shí)，磷酸酶Cdc25被激活，通過(guò)去磷酸化CDK1在Thr14和Tyr15的磷酸位點(diǎn)來(lái)激活CDK1，CDK1反過(guò)來(lái)磷酸化自己的調(diào)節(jié)器，從而增強(qiáng)Wee1/Myt1抑制和Cdc25激活[10-13]。

已知chir-124是一種基于喹諾酮的小分子，在結(jié)構(gòu)上與其他已知的Chk1抑制劑無(wú)關(guān)，它在體外有效地和選擇性地抑制Chk1[14]。本研究采用chir-124代替向卵母細(xì)胞內(nèi)注射干擾RNA的方法來(lái)消耗Chk1，以進(jìn)一步研究Chk1對(duì)豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的影響，并為進(jìn)一步提高豬卵母細(xì)胞成熟的效率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

組織培養(yǎng)基(TCM-199)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、透明質(zhì)酸酶(Hy)、聚乙烯醇(Hepes-TL-PVA)、Triton X-100、anti-tubulin、Hoechst 33342均購(gòu)自Sigma公司。立體顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司；共聚焦顯微鏡購(gòu)自尼康公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自安捷倫公司；培養(yǎng)箱購(gòu)自ESCO公司。

1.2 方法

1.2.1 卵母細(xì)胞的收集和培養(yǎng)

從屠宰場(chǎng)收集豬卵巢放入到添加有75 ng/L青霉素G和50 ng/L硫酸鏈霉素的磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)中運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。用配備有18號(hào)針頭的10 mL注射器反復(fù)抽取卵巢上的2～8 mm卵泡，將卵泡液放入15 mL離心管中，在37 ℃水浴中靜置15 min后棄去上清液，加入Hepes-TL-PVA清洗液重懸沉淀，再次靜置15 min后棄去上清液，反復(fù)2次。將重懸液放入直徑為90 mm培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下，用口吸管挑選卵丘包裹3層以上且細(xì)胞質(zhì)均勻的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)。挑選完成后用培養(yǎng)液洗滌3遍，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中平衡4 h左右的成熟培養(yǎng)液滴內(nèi)(25枚/100 μL)，放入培養(yǎng)箱里(39 ℃，5% CO2),用礦物油覆蓋。

1.2.2 不同濃度chir-124處理卵母細(xì)胞

將chir-124溶于二甲基亞砜(DMSO)中保存，使用時(shí)用TCM199培養(yǎng)液稀釋。將GV期卵母細(xì)胞分別放入含有0、0.1、0.5和1 μmol/L的chir-124 TCM199培養(yǎng)基中，覆蓋石蠟油后在39 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在15 h時(shí)收集卵母細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光染色(使用Hoechst 33342對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行活染，觀察其細(xì)胞核)，并統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞處于各時(shí)期(GV-Ⅰ，GV-Ⅱ，GV-Ⅲ，GV-Ⅳ 4個(gè)時(shí)期)的數(shù)量。隨后在18 h時(shí)收集卵母細(xì)胞，觀察并統(tǒng)計(jì)到達(dá)GVBD的卵母細(xì)胞。

1.2.3 0.5 μmol/L chir-124處理卵母細(xì)胞

使用0.5 μmol/L chir-124在卵母細(xì)胞成熟的不同時(shí)期進(jìn)行處理，處理時(shí)間分別為0～24 h、0～44 h、24～44 h(分別對(duì)應(yīng)GV期到GVBD期、GV期到MII期、GVBD期到MII期)，隨后統(tǒng)計(jì)各階段卵母細(xì)胞的比率。

1.2.4 減數(shù)分裂相關(guān)基因的檢測(cè)

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。分別在0和0.5 μmol/L chir-124處理組各取20個(gè)GVBD期卵母細(xì)胞放入不含Ca2+和Mg2+的PBS中清洗，于液氮中迅速冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用Dynabeads mRNA Kit提取mRNA，利用Oligo(dT)12-18引物和SuperScript逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。用特異性引物(見(jiàn)表1)對(duì)chk1、cdk1、cdc25C、cyclinb1、gwl的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。根據(jù)DyNSmo SYBR Green qPCR Kit方法進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：65～95 ℃，加熱速率0.2 ℃/s，連續(xù)熒光測(cè)量，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中加入SYBR Green，得到最終冷卻到12 ℃的熒光數(shù)據(jù)。通過(guò)生成熔解曲線對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。應(yīng)用2-ΔΔCt法分析基因表達(dá)的相對(duì)定量。

表1 引物序列

1.2.5 免疫熒光染色

將卵母細(xì)胞經(jīng)0.1% PVA-PBS洗滌3次后，放入添有3.7%多聚甲醛的PVA-PBS中，在室溫下固定20 min，然后轉(zhuǎn)移到含0.5%的Triton X-100的PVA-PBS中透膜1 h；室溫下用PBS(含1% BSA)清洗5～8次，每次3 min，放入 PBS(含1% BSA)中在室溫下封閉1 h，之后在一抗中避光、4 ℃孵育過(guò)夜，抗體的稀釋比例是anti-tubulin(1∶200)，anti-chk1(1∶200)；第二天用PBS(含0.1% Tween 20 和 0.01% Triton X-100)室溫洗脫一抗6次，每次3 min，然后用二抗稀釋液在室溫下孵育1 h，稀釋液用PBS(1∶100 Alexa Fluor 488 goat-anti-mouse IgG)；PBS(含0.1% Tween 20 和 0.01% Triton X-100)清洗6次，用Hoechst 33342 復(fù)染核；最后將卵母細(xì)胞放到玻璃載玻片上封片，在共聚焦顯微鏡下拍照。使用Image J軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)設(shè)有3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SAS程序進(jìn)行差異顯著性分析，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Chk1在豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的表達(dá)和定位

Chk1在豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂4個(gè)階段的表達(dá)與定位分別見(jiàn)圖1與圖2。結(jié)果表明，chk1 mRNA在GV期向GVBD期過(guò)渡階段的表達(dá)水平下降，在GVBD期到MI期階段的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，并且持續(xù)到MII期(圖1)。同時(shí)，Chk1蛋白在GV期主要定位在生發(fā)泡內(nèi)，在 GVBD期主要定位在核的周圍，在MI期和MII期主要定位在紡錘體上(圖2)。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。下同圖1 chk1 mRNA在豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中各個(gè)時(shí)期的表達(dá)水平

2.2 不同濃度chir-124對(duì)豬卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的影響

GV期卵母細(xì)胞的四個(gè)階段如圖3所示，用不同濃度(0、0.1、0.5及1 μmol/L)的chir-124對(duì)GV期的豬卵母細(xì)胞進(jìn)行處理后，觀察卵母細(xì)胞處于各個(gè)時(shí)期的比例如圖4和圖5所示。用0.5μmol/L的chir-124處理的卵母細(xì)胞在GV期前3個(gè)階段的影響與其他3組無(wú)顯著差異；但是在GV-IV階段其影響顯著高于其他3組(P<0.05)。而且0.5μmol/L chir-124處理的卵母細(xì)胞到達(dá)GVBD期的百分率顯著高于其他3組(P<0.05)。

DAPI.細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)；Chk1.Chk1蛋白(紅色熒光)；Merged.合成圖圖2 Chk1蛋白在豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中各個(gè)時(shí)期的定位(40×)

圖3 豬卵母細(xì)胞GV期的4個(gè)階段(40×)

圖4 不同濃度chir-124對(duì)GV期豬卵母細(xì)胞比率的影響

圖5 chir-124對(duì)豬卵母細(xì)胞GV期達(dá)到GVBD期比率的影響

2.3 降低Chk1的表達(dá)水平對(duì)卵母細(xì)胞GVBD及隨后成熟的影響

為了進(jìn)一步研究Chk1在豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的作用，用0.5 μmol/L chir-124在卵母細(xì)胞成熟的不同時(shí)期進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)圖6。從GV期開(kāi)始處理卵母細(xì)胞后，發(fā)育到GVBD期(圖6A)和MII期(圖6B)的比率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。然而，從GVBD期開(kāi)始處理卵母細(xì)胞，到達(dá)MII期的比率與對(duì)照組相比差異不顯著(圖6C)。

A.0～24 h；B.0～44 h；C.24～44 h圖6 chir-124處理不同時(shí)期豬卵母細(xì)胞的GVBD與MII百分率

2.4 chir-124處理豬卵母細(xì)胞對(duì)減數(shù)分裂相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組相比，0.5 μmol/L chir-124處理chk1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，同時(shí)gwlmRNA表達(dá)水平也顯著降低(P<0.05)，cdc25C、cdk1和cyclinb1 mRNA表達(dá)水平的與對(duì)照組相比，有增加但無(wú)顯著差異。

圖7 chir-124處理對(duì)減數(shù)分裂相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5 Chk1的表達(dá)對(duì)第二次減數(shù)分裂的影響

如圖8所示，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察紡錘體的變化，與試驗(yàn)組相比，對(duì)照組MI期染色體沒(méi)有完全分離；試驗(yàn)組MI期、MII期紡錘體發(fā)生了很大變化，而對(duì)照組兩個(gè)時(shí)期的紡錘體幾乎沒(méi)有變化。

DAPI.細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)；Tubulin.紡錘體(綠色熒光)；Merged.合成圖圖8 豬卵母細(xì)胞MI期和MII期的紡錘體形態(tài)(大圖10×；小圖40×)

3 討論

3.1 Chk1在豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的表達(dá)和定位

Chk1被報(bào)道在卵母細(xì)胞成熟的每個(gè)階段都有表達(dá)[5-6]。為此，本研究在豬卵母細(xì)胞成熟的4個(gè)階段(GV、GVBD、MI和MII期)分別檢測(cè)了Chk1的表達(dá)與定位。結(jié)果顯示，Chk1從GV期到MII期的各個(gè)時(shí)期都有表達(dá)，在MI期和MII期含量急劇升高，這表明細(xì)胞周期在這兩個(gè)階段容易受到干擾。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Chk1隨著紡錘體的形成而產(chǎn)生變化，也表明Chk1可能通過(guò)影響紡錘體功能進(jìn)而影響豬卵母細(xì)胞的成熟。

3.2 不同濃度chir-124對(duì)豬卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的影響

卵母細(xì)胞GV期可以根據(jù)待成熟時(shí)受抑制狀態(tài)的生發(fā)泡的發(fā)育程度進(jìn)一步分為GV-Ⅰ、GV-Ⅱ、GV-Ⅲ和GV-Ⅳ 4個(gè)階段[15]。根據(jù)Tao等[16]的研究，本研究用不同濃度的chir-124對(duì)GV期的豬卵母細(xì)胞進(jìn)行處理，然后將卵母細(xì)胞分別定位于GV期的不同階段。結(jié)果顯示，所有處理組處于GV-Ⅰ期的卵母細(xì)胞比率均比對(duì)照組低，說(shuō)明Chk1的消耗加快了卵母細(xì)胞從GV-Ⅰ期發(fā)育到GV-Ⅳ期的速度，且用0.5μmol/L的chir-124處理時(shí)卵母細(xì)胞達(dá)到GV-Ⅳ的比率顯著高于對(duì)照組。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中都使用了這個(gè)濃度。

3.3 降低Chk1的表達(dá)水平對(duì)卵母細(xì)胞GVBD及隨后成熟的影響

在小鼠中，降低Chk1的表達(dá)可以促進(jìn)卵母細(xì)胞到達(dá)GVBD的速率，但是對(duì)后續(xù)的減數(shù)分裂進(jìn)程沒(méi)有影響[5]。然而在豬卵母細(xì)胞中，Chk1的耗竭會(huì)降低卵母細(xì)胞成熟的速率，并對(duì)MI期卵母細(xì)胞的染色體排列產(chǎn)生不利影響[6]。本研究中，用0.5 μmol/L chir-124對(duì)GV期豬卵母細(xì)胞進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)Chk1的消耗顯著增加了豬卵母細(xì)胞達(dá)到GVBD的比率，并且相應(yīng)地增加了達(dá)到MII期的比率，但是在GVBD后再處理chir-124消耗Chk1時(shí)，這種促進(jìn)效果消失。因此，推測(cè)Chk1只是在GVBD前對(duì)豬卵母細(xì)胞的成熟有影響，即加快卵母細(xì)胞到達(dá)GVBD 的速率，但對(duì)隨后的成熟沒(méi)有影響。這與Nie等[6]的結(jié)果相反，可能是由于處理方法不同，對(duì)Chk1相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生了不同的影響，具體機(jī)制仍有待探究。

3.4 chir-124處理豬卵母細(xì)胞對(duì)減數(shù)分裂相關(guān)基因表達(dá)的影響

DNA損傷檢查點(diǎn)由ATM、ATR、Chk1或Chk2、Cdc25和其他相關(guān)的下游蛋白組成，通過(guò)信號(hào)通路ATM/ATR-Chk1/Chk2-Cdc25對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有廣泛的作用[17-18]。其中Cdc25的磷酸化會(huì)導(dǎo)致CDK1的失活，而細(xì)胞減數(shù)分裂的開(kāi)始與CDK1的活性密切相關(guān)[19]。本研究檢測(cè)了MII期卵母細(xì)胞中與CDK1相關(guān)基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Chk1的消耗顯著降低了gwl基因的表達(dá)，并且略微提升了cdc25C和cyclinb1基因的表達(dá)水平。其中，gwl基因負(fù)反饋調(diào)節(jié)cdk1基因，cdc25C和cyclinb1正反饋調(diào)節(jié)cdk1基因的去磷酸化，使其保持相對(duì)較高的活性水平[20-22]，進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的進(jìn)程。

3.5 Chk1的表達(dá)對(duì)第二次減數(shù)分裂的影響

Chk1對(duì)于SAC的功能和將BubR1募集到動(dòng)粒中是必需的[23]。在小鼠卵母細(xì)胞中，Chk1的消耗對(duì)于SAC的功能沒(méi)有影響，但是Chk1的過(guò)表達(dá)激活了SAC并阻止同源染色體的分離[5]。在豬卵母細(xì)胞中，Chk1的消耗減少了SAC相關(guān)蛋白的表達(dá)量[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組MI期和MII期卵母細(xì)胞的染色體數(shù)量與狀態(tài)一致，即卵母細(xì)胞沒(méi)有渡過(guò)MI期，停滯在MI期；而chir-124處理組的卵母細(xì)胞，MII期的染色體數(shù)量相較于MI期明顯減半，說(shuō)明Chk1的表達(dá)會(huì)活化SAC，從而阻止同源染色體的分離，將卵母細(xì)胞固定在MI期。

4 結(jié)論

在豬卵母細(xì)胞體外成熟的GV期添加0.5 μmol/L chir-124來(lái)抑制Chk1的活性，可以促進(jìn)豬卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，并促進(jìn)后續(xù)的成熟。