王金艷 肖亞利 陳麗東 宋 紅 趙 敏 王國龍

急性心肌梗死(acute myocadical infraction，AMI)是臨床上較為常見的急危重癥和心源性猝死的主要原因，具有起病急、病情進(jìn)展迅速的特點(diǎn)，多數(shù)患者無法在最佳治療時間窗內(nèi)得到有效救治，因此研發(fā)出能夠有效緩解AMI疾病進(jìn)展的藥物將具有重要的臨床意義[1]。熊果酸(ursolic acid，UA)是天然存在于杜鵑花科灌木熊果中的一種五環(huán)三萜類化合物，能夠通過抑制鈣超載對缺血性腦損傷起到保護(hù)作用，而鈣超載是AMI后心肌組織和細(xì)胞不可逆損傷的重要病理機(jī)制[2,3]。因此本研究通過造模前3天開始給予UA預(yù)處理，并以鈣通道阻斷劑維拉帕米(verapami，Ver)為陽性對照藥物，研究UA對AMI后心功能及心肌組織病理改變的影響。

材料與方法

1.材料：(1)藥物與試劑：UA購自上海玉博生物科技有限公司(純度≥98%)；Ver購自黑龍江多多藥業(yè)有限責(zé)任公司(規(guī)格2ml:5mg)；NBT購自上海前進(jìn)試劑廠；TUNEL試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司。(2)實(shí)驗(yàn)動物：180只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量230±20g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心[實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(冀)2018-004]，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(亮暗時間1∶1、室溫25±1℃、相對濕度65%±5%)。

2.動物分組、給藥預(yù)處理與造模：(1)分組與給藥預(yù)處理：180只大鼠數(shù)字編碼后按照數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)，AMI組，UA低、中、高劑量(10、20、40mg/kg)組和Ver(2.5mg/kg)預(yù)處理組，每組30只。精確稱取UA并加入適量0.9%氯化鈉溶液制備濃度10、20、40mg/ml的UA溶液；UA低、中、高劑量預(yù)處理組分別于造模前3天開始1次/天腹腔注射給予10、20、40mg/ml的UA溶液，Ver預(yù)處理給予Ver溶液，Sham組和AMI組給予0.9%氯化鈉溶液，注射劑量均為1ml/kg。(2)造模：參照吳慶景等[4]報(bào)道的方法，通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支復(fù)制AMI大鼠模型；結(jié)扎后左心室心肌蒼白，心電圖ST段持續(xù)抬高或T波高聳即可判斷造模成功。假手術(shù)組除不結(jié)扎左冠狀動脈前降支外，其余操作同AMI組。

3.心功能指標(biāo)和心肌梗死體積檢測：①每組隨機(jī)取10只大鼠，通過心臟超聲多普勒檢測左心室舒張、收縮末期內(nèi)徑(LVIDd、LVIDs)、射血分?jǐn)?shù)(EF)和每搏排出量(SV)，連續(xù)檢測5個心動周期取平均值；②頸椎脫臼處死，取心臟置-20℃冰箱凍存0.5h，取左心室并沿房室溝方向平行切為5片，置2% NBT溶液37℃避光孵育1h，通過圖像分析系統(tǒng)計(jì)算心肌梗死體積。

4.心肌組織病理學(xué)檢查及評分：每組大鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)取10只，麻醉后開胸，取心臟組織并切取左心室，置4%多聚甲醛溶液固定72h后行石蠟包埋、4μm厚度切片、二甲苯透明、梯度乙醇脫蠟后，行HE染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病理學(xué)改變。損傷評分：由兩名實(shí)驗(yàn)人員參照葉蘭等[5]報(bào)道的方法獨(dú)立評分后取平均值：正常心肌計(jì)0分，病變視野比例≤1/4計(jì)1分、1/4～1/2計(jì)2分、≥1/2計(jì)3分，從變性壞死、出血、間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤4方面評分，總和即為損傷評分。

5.細(xì)胞凋亡檢測：石蠟切片經(jīng)二甲苯透明和梯度乙醇脫蠟水化處理后，參照TUNEL試劑盒說明進(jìn)行染色處理，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡狀況。凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)計(jì)算：每張切片分別由兩名實(shí)驗(yàn)人員隨機(jī)取5個不重疊視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

6.心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢測：各組取剩余的10只大鼠，頸椎脫臼處死后開胸取心臟，取左心室并切割成5mm3方塊，4%戊二醛溶液4℃固定24h、1%鋨酸4℃固定3h，梯度乙醇和無水丙酮脫水、氧化丙烯置換和環(huán)氧樹脂包埋后，70nm厚度超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重電子染色后通過透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

結(jié) 果

1.各組大鼠心功能指標(biāo)比較：與Sham組比較，AMI組大鼠LVIDd、LVIDs顯著升高而EF、SV顯著降低(P<0.01)；與AMI組比較，UA中、高劑量和Ver預(yù)處理組LVIDd、LVIDs降低且EF、SV升高(P<0.05或P<0.01)；與Ver預(yù)處理組比較，UA高劑量預(yù)處理組LVIDs降低且SV升高(P<0.05或P<0.01,表1)。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

2.各組大鼠心肌梗死體積比較：與Sham組比較，AMI組心肌梗死體積顯著升高(P<0.01)；與AMI組比較，UA中、高劑量和Ver預(yù)處理組梗死體積降低(P<0.01)；與Ver預(yù)處理組比較，UA高劑量預(yù)處理組梗死體積降低(P<0.01，表2)。

表2 各組大鼠心肌梗死體積、損傷評分、AI比較

3.各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變及損傷評分比較：Sham組大鼠左心室心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常；AMI組呈現(xiàn)心肌纖維部分?jǐn)嗔?，?xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂，胞核固縮、偏移，間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤等病理改變；與AMI組比較，UA各劑量和Ver預(yù)處理組上述形態(tài)結(jié)構(gòu)改變呈不同程度減輕，其中UA高劑量預(yù)處理組未見心肌纖維斷裂、間質(zhì)水腫不明顯。與Sham組比較，AMI組大鼠心肌損傷評分顯著升高(P<0.01)；與AMI組比較，UA中、高劑量和Ver預(yù)處理組損傷評分降低(P<0.05或P<0.01)；與Ver預(yù)處理組比較，UA高劑量預(yù)處理組損傷評分降低(P<0.05,圖1,表2)。

4.各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較：Sham組心肌可見少量凋亡細(xì)胞；與Sham組比較，AMI組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多、AI顯著升高(P<0.01)；與AMI組比較，UA低、中、高劑量和Ver預(yù)處理組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，AI降低(P<0.01)；與Ver預(yù)處理組比較，UA高劑量預(yù)處理組AI降低(P<0.01,圖2,表2)。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變比較(HE，×200)A.Sham組；B.AMI組；C.UA低劑量預(yù)處理組；D.UA中劑量預(yù)處理組；E.UA高劑量預(yù)處理組；F.Ver預(yù)處理組

5.各組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變比較：Sham組染色質(zhì)分布均勻、線粒體結(jié)構(gòu)清晰，未見異常；AMI組呈現(xiàn)平滑肌絲溶解斷裂，染色質(zhì)固縮，核仁邊界不清，線粒體膜破裂、嵴變短、嵴溶解消失等超微結(jié)構(gòu)病變；UA各劑量和Ver預(yù)處理組上述超微結(jié)構(gòu)病變呈不同程度減輕，其中UA高劑量預(yù)處理組心肌纖維少量斷裂，染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)完整,詳見圖3。

討 論

隨著人民生活水平的提高以及人口老齡化的加劇，AMI發(fā)生率呈逐年上升趨勢[6]。近年來中醫(yī)藥防治AMI得到廣泛關(guān)注，熊果酸是可藥用植物熊果的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性[7～9]，而氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)以及繼發(fā)性細(xì)胞凋亡在AMI病理變化過程中發(fā)揮著重要作用[10～12]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)UA預(yù)處理能夠明顯降低AMI大鼠LVIDd、LVIDs并升高EF、SV，降低左心室心肌梗死體積；明顯改善心肌纖維斷裂，胞核固縮、偏移，間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤等病理性改變，并且UA高劑量預(yù)處理組作用優(yōu)于Ver預(yù)處理組，提示UA預(yù)處理對AMI大鼠心功能和心肌病理學(xué)改變具有保護(hù)作用。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較(TUENL，×400)A.Sham組；B.AMI組；C.UA低劑量預(yù)處理組；D.UA中劑量預(yù)處理組；E.UA高劑量預(yù)處理組;F.Ver預(yù)處理組

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變比較(透射電子顯微鏡，×10000)A.Sham組；B.AMI組；C.UA低劑量預(yù)處理組；D.UA中劑量預(yù)處理組；E.UA高劑量預(yù)處理組;F.Ver預(yù)處理組

心肌細(xì)胞具有不可再生性，因此挽救心肌梗死區(qū)半暗帶細(xì)胞是改善AMI患者預(yù)后的關(guān)鍵[13]。細(xì)胞凋亡是一種程序化自主死亡過程，對維持生理狀態(tài)下細(xì)胞新陳代謝具有重要作用，但病理性刺激心肌細(xì)胞過度凋亡在AMI疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用[14,15]。線粒體膜通透性改變導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)，將啟動線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑[16，17]。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI大鼠左心室心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，與張顯純等[18]、袁輝等[19]研究結(jié)果一致；梗死區(qū)心肌細(xì)胞呈現(xiàn)肌絲溶解斷裂，線粒體膜破裂、嵴斷裂溶解等超微結(jié)構(gòu)病變，與張麗麗等[20]研究結(jié)果一致。經(jīng)UA預(yù)處理能夠明顯抑制AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡并降低AI，抑制心肌細(xì)胞線粒體細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)病變，UA高劑量預(yù)處理組上述作用優(yōu)于Ver預(yù)處理組，提示UA對AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變具有抑制作用。

綜上所述，UA預(yù)處理對AMI大鼠心功能和左心室心肌病理學(xué)改變及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。