袁 順 陳若詩 王志維

主動脈夾層(aortic dissection，AD)是一種心血管系統(tǒng)的危重急癥，起病急驟，進展迅速，病情兇險，病死率極高。且AD主要發(fā)生于老年人中，在青年人中AD少見。主動脈壁由內(nèi)膜、中膜和外膜共同構(gòu)成。而整個主動脈夾層過程都發(fā)生在中層及以內(nèi)的結(jié)構(gòu)中：由內(nèi)膜開始撕裂，在中膜向外延伸，并最終在接近外膜的位置發(fā)生撕裂。主動脈夾層的主要病理特征之一為主動脈中層退行性變 (aortic medial degeneration，AMD)。AMD的主要特征是主動脈血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)數(shù)目減少、表型轉(zhuǎn)化、細胞外基質(zhì)紊亂、彈性纖維紊亂斷裂等[1]。VSMC表型由收縮型向分泌型轉(zhuǎn)化。因此，研究探討主動脈中膜VSMC表型轉(zhuǎn)化的誘因及具體機制對于主動脈夾層的防治與治療具有極其重要的作用。

鐵元素參與許多重要蛋白質(zhì)和酶的生物合成及活性，如血紅蛋白、細胞色素和過氧化物酶等[2]。亞鐵蛋白在多種生物活動如氧氣運輸、線粒體呼吸、中間產(chǎn)物和衍生物代謝、核酸復(fù)制和修復(fù)、細胞防御和細胞信號等中亦發(fā)揮著重要作用[3]。異常的鐵代謝可導(dǎo)致一系列疾病。鐵過載可導(dǎo)致肝臟損傷、胰島素抵抗、心肌病、神經(jīng)退行性疾病，并可直接損傷成骨組織和骨骼重塑[4～7]。缺鐵 (iron deficiency，ID) 可引起更重的慢性心力衰竭癥狀和更嚴(yán)重的心血管后果等病理變化[8]。此外，妊娠期缺鐵可損害胎兒腦發(fā)育和認知能力[9]。ID還可以通過誘導(dǎo)相關(guān)激素的產(chǎn)生從而影響骨骼健康[10]。此外，有研究指出，缺鐵可增加肺血管對缺氧的敏感度，并導(dǎo)致肺動脈高壓的發(fā)生[11]。老年人因胃腸道吸收功能減弱，機體營養(yǎng)狀況較差，因而很多老年人都存在缺鐵或亞臨床缺鐵狀態(tài)。

目前關(guān)于鐵元素與血管平滑肌細胞表型的研究在主動脈夾層相關(guān)領(lǐng)域中尚無報道，其具體發(fā)生機制也不明確。結(jié)合老年人中缺鐵現(xiàn)象比較常見及AD多發(fā)生于老年人中，筆者檢測了臨床主動脈夾層患者的血清鐵水平，發(fā)現(xiàn)其血清鐵較同年齡段非AD患者顯著降低(圖1)。因此，結(jié)合鐵元素生物學(xué)功能，筆者初步推測，缺鐵可能通過影響主動脈血管平滑肌細胞的表型，導(dǎo)致主動脈中膜退行性變，從而促進主動脈夾層的發(fā)生。

材料與方法

1.采集人體血管標(biāo)本：本研究選擇2018年2月～2019年2月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管外科被確診為Stanford Ⅰ型夾層并行全主動脈弓置換的患者6例為實驗組，患者年齡60～73歲，平均年齡為65.9歲，男女性別比為1∶1?；颊呔?jīng)CTA檢查確診為AD，且夾層的撕裂口位于升主動脈。所有實驗組患者術(shù)前均無冠心病、外周血管疾病、關(guān)節(jié)炎及膜性腎病?；颊呔谌朐汉笮屑痹\手術(shù)，術(shù)中取病變的血管組織。選擇同期在武漢大學(xué)人民醫(yī)院行心臟移植手術(shù)的患者6例為對照組，選取的移植患者均無大血管疾病。夾層主動脈組織在手術(shù)過程中取出并于冰中轉(zhuǎn)送至實驗室進行處理。術(shù)前所有試驗方案均已告知家屬，并簽署知情同意書，且本部分試驗已經(jīng)由武漢大學(xué)倫理學(xué)委員會審批同意。兩組患者的血管標(biāo)本取出后，立即進行處理并分裝，一部分凍存于液氮中，一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋以行后續(xù)檢測。另外，采集23例主動脈夾層患者的血清和23例筆者所在科室非夾層患者的血清，并對血清中的鐵含量進行檢測。

2.實驗動物及分組：選擇3周齡的野生型小鼠24只，隨機分為4組，每組6只。對照組喂普通小鼠維持飼料；β氨基丙腈酯(BAPN)組于第3周開始喂含2.5g/kg BAPN 小鼠維持飼料；ID組第3周起喂含5mmol/L鐵的維持飼料[10]；ID+BAPN組(IB組)于第3周開始喂含2.5g/kg BAPN及5mmol/L鐵的維持飼料，各組均持續(xù)喂養(yǎng)4周。若小鼠在AD造模過程中死亡則立即解剖(不另外補充小鼠)以明確死因，用4%多聚甲醛保存血管標(biāo)本。各組存活小鼠在造模第4周，經(jīng)戊巴比妥麻醉后，游離小鼠主動脈，采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片后行后續(xù)檢測。

3.普魯士藍染色觀察血管中鐵含量的變化：采用普魯士藍染色法測定主動脈鐵含量。石蠟切片脫蠟至水。1∶1比例混合亞鐵氫化鉀溶液和鹽酸溶液制備普魯士藍染液染，染色1h后蒸餾水洗兩次；核固紅染料染核1～5min，自來水下沖洗，脫水封片，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

4.HE染色和EVG染色觀察血管形態(tài)學(xué)改變：(1)HE染色：石蠟切片脫蠟至水，自來水洗；蘇木精染色3～5min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍，水洗；入伊紅染液中染色5min；脫水封片；顯微鏡觀察。(2)EVG染色：石蠟切片脫蠟至水，自來水洗；乙醇蘇木精∶三氯化鐵∶碘液=5∶2∶2混合成EVG染液，切片入EVG染液染30min，自來水沖洗；三氯化鐵分化液分化，自來水洗，如此反復(fù)并在顯微鏡下控制分化程度，至彈力纖維呈紫黑色，背景呈灰白色近無色；將飽和苦味酸與麗春紅9∶1混合成VG染液復(fù)染1～3min，快速水洗，脫水封片；顯微鏡觀察。

5.免疫組織化學(xué)檢測血管相關(guān)蛋白表達變化情況：將切片置于60℃恒溫烘箱中烤片、融蠟1h，然后將標(biāo)本置于二甲苯溶液中進一步脫去殘余石蠟，其后分別將切片置于100%、95%、85%、75%和50%乙醇、蒸餾水中水化。PBS漂洗2次，每次5min；切片于0.1%Triton溶液處理15min，PBS漂洗3次，每次5min；將切片置于pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中，微波修復(fù)；待修復(fù)液自然冷卻后，于3% H2O2溶液中浸泡10min，封閉組織標(biāo)本中的過氧化物酶，山羊血清封閉組織切片中的非特異性抗體，一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5min，二抗常溫孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min，后用氨基聯(lián)苯胺于顯微鏡下顯色，蘇木精對比染色，鹽酸乙醇脫色，氨水返藍。脫水封片，顯微鏡下觀察拍照。

6.Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達：取綠豆大組織標(biāo)本，加入適量比例的Cocktail及PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液用以提取總蛋白，蛋白樣品冰上超聲碎裂；所得樣品于冷凍離心機中以4℃ 12000r/min離心20min，取上清；根據(jù)蛋白裂解液RIPA 的體積，以適當(dāng)?shù)谋壤尤氲鞍咨蠘泳彌_液混勻，100℃恒溫浴10min，所獲蛋白樣本凍存于-80℃。每孔蛋白上樣量為20μg，電泳電壓90V，電流40mA，以12%濃度聚丙烯酰胺凝膠進行Western blot法電泳。在電流200mA，電壓100V 條件下電轉(zhuǎn)1h45min。以肌動蛋白(actin)為內(nèi)參，以羊抗鼠、羊抗兔HRP二抗顯影，掃膜并分析。

結(jié) 果

1.AD組和對照組主動脈病理變化及鐵含量比較：筆者納入了23例AD患者和23例非AD患者進行血清鐵濃度測定，通過對臨床患者的血清學(xué)結(jié)果分析顯示，AD組患者血清鐵濃度為13.79±1.50μmol/L，對照組血清鐵濃度為18.90±1.71μmol/L，P=0.029(圖1A)。EVG染色結(jié)果顯示，AD組彈力纖維斷裂明顯較對照組增多(圖1中B、C)，AD組血管組織切片病理特征符合AD組織病理變化。此外，筆者還用普魯士藍染色驗證組織內(nèi)鐵含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AD組主動脈中鐵含量較對照組明顯減低(圖1中D～F)。

圖1 AD組和對照組主動脈病理變化及鐵含量變化(×40)A.AD患者與非AD患者血清鐵含量；B.供體主動脈組織EVG染色；C.AD患者主動脈組織EVG染色；D.供體主動脈組織普魯士藍染色(鐵染色)；E.AD患者主動脈組織普魯士藍染色(鐵染色)；F.供體主動脈與AD患者主動脈組織普魯士藍染色陽性率情況比較

2.AD組和對照組主動脈表型變化情況：免疫組化染色結(jié)果顯示，AD組的收縮表型相關(guān)蛋白α-SMA表達較對照組明顯降低(圖2中A～C)，而分泌表型相關(guān)蛋白OPN表達升高(圖2中D～F)，P<0.05。即AD患者主動脈的收縮能力降低，其對外源性損傷的應(yīng)變能力和抗損傷能力降低。

圖2 AD組和對照組主動脈各蛋白表達情況(免疫組化染色，×40)A.供體主動脈組織α-SMA表達情況；B.AD患者主動脈組織α-SMA表達情況；C.供體主動脈組織與AD患者主動脈組織α-SMA表達情況比較；D.供體主動脈組織OPN表達情況；E.AD患者主動脈組織OPN表達情況；F.供體主動脈組織與AD患者主動脈組織OPN表達情況比較

3.各組造模小鼠生存率比較：在給藥第21天，IB組小鼠死亡5只存活1只，BAPN組小鼠死亡3只存活3只，WT 組和ID組小鼠均存活。IB組死亡率明顯高于BAPN 組(83.3% vs 50.0%,圖3)。

4.各組小鼠主動脈病理變化及鐵含量變化情況：普魯士藍染色結(jié)果顯示BAPN組較對照組、ID組較對照組及IB組較BAPN組小鼠主動脈中鐵含量降低(圖4中A～E)。EVG染色結(jié)果顯示，ID組主動脈較對照組彈力纖維斷裂略增多，BAPN組主動脈較對照組主動脈彈力纖維斷裂明顯增多，IB組較BAPN組彈力纖維斷裂增多，即IB組小鼠主動脈的損傷較BAPN組更為嚴(yán)重(圖4中F～I)。

圖3 各組小鼠生存曲線

圖4 各組小鼠造模后主動脈結(jié)構(gòu)及主動脈組織中鐵含量的情況(×40)A.對照組小鼠主動脈普魯士藍染色；B.缺鐵組小鼠主動脈普魯士藍染色；C.BAPN組小鼠主動脈普魯士藍染色；D.IB組小鼠主動脈普魯士藍染色；E.各組小鼠主動脈普魯士藍染色陽性率情況比較；F.對照組小鼠主動脈EVG染色；G.缺鐵組小鼠主動脈EVG染色；H.BAPN組小鼠主動脈EVG染色；I.IB組小鼠主動脈EVG染色；*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

5.各組小鼠主動脈表型變化情況：免疫組化染色結(jié)果顯示，BAPN組α-SMA表達顯著下調(diào)，低鐵干預(yù)使得α-SMA的表達進一步降低(圖5中A～E)。此外，BAPN組OPN表達顯著升高，低鐵干預(yù)后亦可增加OPN的表達進一步上調(diào)，而IB組較BAPN組無明顯改變(圖5中F～J)。

討 論

受早年的醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)水平的限制，AD于人群中的檢出率及發(fā)現(xiàn)率低。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)水平尤其是影像學(xué)技術(shù)的進步及普及，以及人們對健康狀況重視程度的升高，AD的檢出率越來越高，且多出現(xiàn)于老年人中。然而，AD的確切發(fā)病機制仍不清楚。因此，闡明AD發(fā)生的原因可能對AD的預(yù)防、診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。近年來有研究表明，ID可通過影響線粒體呼吸過程，從而降低心肌細胞的收縮功能，從而導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，ID可能通過影響線粒體功能，使得ATP合成顯著降低，細胞活性氧水平升高，導(dǎo)致平滑肌細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化導(dǎo)致VSMC功能障礙，從而導(dǎo)致AMD乃至AD發(fā)生。

圖5 各組小鼠主動脈各蛋白表達情況(免疫組化染色，×40)A.對照組小鼠主動脈α-SMA表達情況；B.缺鐵組小鼠主動脈α-SMA表達情況；C.BAPN組小鼠主動脈α-SMA表達情況；D.IB組小鼠主動脈α-SMA表達情況；E.各組小鼠主動脈組織α-SMA表達情況比較；F.對照組小鼠主動脈OPN表達情況；G.缺鐵組小鼠主動脈OPN表達情況；H.BAPN組小鼠主動脈OPN表達情況；I.IB組小鼠主動脈OPN表達情況；J.各組小鼠主動脈OPN表達情況比較；*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

鐵元素參與構(gòu)成機體多種重要的蛋白，因而鐵穩(wěn)態(tài)對機體、細胞乃至細胞器發(fā)揮正常的生理功能具有重要的作用[3]。外源性刺激可以誘導(dǎo)主動脈平滑肌細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。正常主動脈組織中血管平滑肌細胞多為分化型，即收縮表型，其特點為細胞增殖能力弱，分泌的細胞外基質(zhì)量極少，并表達特定的收縮蛋白。當(dāng)血管受損時，這些細胞轉(zhuǎn)化為合成表型，在該表型下細胞發(fā)生增殖并向損傷部位遷移[13]。此外，有研究結(jié)果表明，能量釋放與線粒體鐵濃度梯度密切相關(guān)，說明鐵與能量代謝密切相關(guān)，而線粒體功能障礙與早期VSMCs表型轉(zhuǎn)化有關(guān)[14，15]。此外，線粒體可通過多種分子機制致使ROS產(chǎn)生，如呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、NAD(P)H/NAD(P)+等的損傷反應(yīng)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，過量的ROS可誘導(dǎo)VSMCs從收縮表型轉(zhuǎn)化為分泌表型，使得VSMCs收縮能力下調(diào)，從而導(dǎo)致血管張力發(fā)生改變，并可能因此導(dǎo)致AD的發(fā)生[16，17]。因此筆者推測，ID可能通過誘導(dǎo)VSMCs 表型轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致AMD及AD的發(fā)生。

為探討表型轉(zhuǎn)化在ID誘導(dǎo)AD發(fā)生中的作用，筆者構(gòu)建了小鼠AD模型，并在常規(guī)AD造?；A(chǔ)上，對小鼠飼料增加了ID處理，小鼠結(jié)果顯示IB組小鼠生存周期較BAPN組明顯降低，AD發(fā)生率明顯升高。免疫組化染色結(jié)果顯示，IB組較BAPN組小鼠主動脈的VSMCs表型由收縮型向分泌型轉(zhuǎn)化更明顯，單ID處理的小鼠亦出現(xiàn)出少許表型轉(zhuǎn)化。當(dāng)然本研究具有一定的缺陷性。為使結(jié)果更具有可信性，還可通過限制小鼠體內(nèi)線粒體功能進行進一步驗證。同時，筆者誘導(dǎo)小鼠AD模型時采用的是幼年小鼠，與臨床上老年人AD多發(fā)的機體狀態(tài)可能存在一定的差異。此外，BAPN誘導(dǎo)小鼠AD發(fā)生較血管緊張素泵誘導(dǎo)的AD模型具有一定的局限性，需更多的體內(nèi)實驗多方驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，ID通過誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化，從而在導(dǎo)致AMD和AD的發(fā)生、發(fā)展中存在一定的作用。同時，臨床上ID及AD均在老年人群中多發(fā)。鐵元素為機體的一種重要的微量元素，且該元素在體內(nèi)的水平在臨床上極易檢測，且機體內(nèi)鐵水平作為一種AD可能的誘導(dǎo)因子，ID可誘導(dǎo)更嚴(yán)重的AMD現(xiàn)象，及時發(fā)現(xiàn)亞臨床缺鐵現(xiàn)象并即使補充也許可在一定程度上預(yù)防AD的發(fā)生。由于未進行體內(nèi)實驗的研究，因而筆者推測，在尚未發(fā)生AMD時或發(fā)生表型轉(zhuǎn)化初期補充鐵含量也許在預(yù)防及改善早期AD的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用。