余良飛

高遷移率族蛋白（high-mobility group box，HMGB）屬于高遷移率族蛋白超家族成員，是一種廣泛存在于真核細胞中的非組蛋白的核DNA 結(jié)合蛋白，其家族成員均具有典型的HMG 核[1]。目前，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)了HMGB1、HMGB2、HMGB3 等成員，它們多分布于細胞核中[2]。HMGB1 作為一種高度保守的核結(jié)合蛋白，其參與了基因的重組、調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，并在細胞增殖分化、腫瘤細胞的遷移及炎癥損傷等過程中起著重要作用[3]。研究表明，HMGB1 表達受抑制后，端粒的穩(wěn)態(tài)被破壞，進而抑制了DNA 損傷的修復(fù)，從而提高了乳腺癌細胞的敏感性[4]。因此，HMGB1 可能是乳腺癌化療敏感性的關(guān)鍵基因之一。為了探究HMGB1 在乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲過程中的作用，本文采取了外源HMGB1刺激乳腺癌細胞株MDA-MB-453，現(xiàn)報道如下研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 一般資料

細胞株和主要試劑：人乳腺癌細胞株MDA-MB-453 購自中科院上海細胞庫，L15 基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶購自美國Gibco 公司，青霉素-鏈霉素混合液購自美國Hyclone公司，Matrigel 和24 孔板小室購自美國康寧公司，CCK-8 試劑盒和二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide,DMSO）購自美國Sigma公司，重組HMGB1 購自美國R&D 公司。細胞培養(yǎng)：將凍存的MDA-MB-453 細胞常規(guī)復(fù)蘇重懸后，采用L15 完全培養(yǎng)基（含10% FBS，100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素），置于37 ℃、含5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二日更換1 次培養(yǎng)基，之后每3 天更換1 次。當(dāng)細胞融合度達到80%～90%時取最好狀態(tài)的細胞用于后續(xù)實驗。細胞傳代時，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min，后加入2 mL 的完全培養(yǎng)基終止消化后，1 000 r/min離心3 min，棄上清收集沉淀細胞，用完全培養(yǎng)液重懸制成新細胞懸液后按所需比例傳代或接種。

1.2 研究方法

細胞增殖活性檢測：試驗設(shè)置空白組和藥物組，藥物組分別用100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL 的重組HMGB1刺激MDA-MB-453 細胞株。待細胞密度達80%～90%時，將細胞消化計數(shù)，按照密度為0.8×105個/mL 的密度接于96 孔板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，按照上述分組將藥物加入96 孔板中，每組設(shè)置8 個復(fù)孔，加入藥物后接著培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)48 h 向每孔中加入10 μL CCK，37 ℃培養(yǎng)4 h，然后在450 nm 處測定其吸光度，每組8 個復(fù)孔，測定重復(fù)3 次。

細胞劃痕試驗：試驗設(shè)置空白組和藥物組，藥物組為400 ng/mL 的重組HMGB1 刺激MDA-MB-453 細胞株。細胞消化、計數(shù)后，按5×105的密度接種到6 孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細胞密度達到80%～90%時，用200 μL 的槍頭，在板蓋進行劃痕（劃痕時動作要輕，既要保證劃痕的質(zhì)量，又不能破壞細胞）；劃痕后拍照，記錄劃痕0 h 細胞狀態(tài)（每個孔都要記錄）；拍照后吸掉原有培養(yǎng)基，加1 mL PBS 清洗細胞兩遍；然后向板中加入配好的含有藥物的培養(yǎng)基（注意要標(biāo)記好每孔的藥物濃度）；最后放入37 ℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在12 h、24 h 和48 h 采用倒置顯微鏡觀察、拍照。采用Image-Pro plus 6.0 軟件對遷移距離進行分析。

細胞遷移率=（0 h 劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%

Transwell 檢測細胞侵襲水平：試驗設(shè)置空白組和藥物組，藥物組為400 ng/mL 的重組HMGB1 刺激MDA-MB-453 細胞株。在小室中提前鋪設(shè)Matrigel 膠，將1×104個細胞加入血清培養(yǎng)基的上室，下室為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。24 h 后取出小室，依次經(jīng)甲醛固定和結(jié)晶紫染色，采用倒置顯微鏡計算侵襲細胞數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL 和800 ng/mL 的外源HMGB1對MDA-MB-453 乳腺癌細胞增殖影響；400 ng/mL 的外源HMGB1對MDA-MB-453 乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，不同劑量的HMGB1 處理組采用單因素方差分析，均數(shù)兩兩比較采用配對t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外源HMGB1 刺激對乳腺癌細胞增殖的影響

與空白組相比，不同劑量組的外源HMGB1 刺激MDAMB-453 乳腺癌細胞48 h 后，MDA-MB-453 細胞增殖均明顯升高（P＜0.05）；100 ng/mL 和200 ng/mL 外源HMGB1 刺激的細胞增殖存在差異（P＜0.05），但200 ng/mL、400 ng/mL 與800 ng/mL 組間細胞增殖則無明顯差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 不同劑量HMGB1 對乳腺癌MDA-MB-453 細胞增殖的影響

2.2 外源HMGB1 刺激對各組乳腺癌細胞遷移的影響

采用細胞劃痕試驗檢測外源HMGB1 刺激后乳腺癌細胞的遷移，結(jié)果顯示，經(jīng)400 ng/mL 的HMGB1 處理48 h 后，細胞的遷移明顯增強（P＜0.01），且呈時間依賴性（圖2）。

2.3 外源HMGB1 刺激對各組乳腺癌細胞侵襲的影響

采用Transwell 法檢測400 ng/mL 外源HMGB1 處理24 h 后MDA-MB-453 細胞的穿膜數(shù)量，發(fā)現(xiàn)HMGB1 處理的加藥組細胞穿膜數(shù)量高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖3）。

3 討論

HMGB1 作為比較保守的高遷移率族蛋白家族成員，其含有2個與DNA 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和1 個可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的C 端，參與多種炎癥因子的釋放[5]。研究表明HMGB1 在細胞的分化增殖和遷移侵襲中也發(fā)揮著重要作用[6]，此外HMGB1 作為一種凋亡和自噬調(diào)節(jié)因子，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要功能[7]。已有研究表明HMGB1 參與了結(jié)直腸癌[8]、肝癌[9]、胃癌[10]、肺癌[11]等腫瘤細胞的凋亡、遷移和侵襲過程，影響腫瘤細胞釋放免疫因子。Huang BF 等[12]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1 在乳腺癌組織表達明顯升高，這表明HMGB1 在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。

圖2 外源HMGB1 刺激對各組乳腺癌細胞遷移的影響

圖3 外源HMGB1 刺激對各組乳腺癌細胞侵襲的影響

本研究中，不同劑量的外源HMGB 刺激乳腺癌MDA-MB-453細胞后，采用CCK-8 檢測細胞增殖情況，與空白組相比，不同劑量組的外源HMGB1 刺激MDA-MB-453 乳腺癌細胞48 h 后，MDA-MB-453 細胞增殖均明顯升高（P＜0.05）；100 ng/mL 和200 ng/mL 外源HMGB1 刺激的細胞增殖存在差異（P＜0.05），但200 ng/mL、400 ng/mL 與800 ng/mL 組間細胞增殖則無明顯差異（P＞0.05）；由此可見在較低劑量（＜200 ng/mL）情況下，細胞增殖隨HMGB1 劑量的增加而增強，當(dāng)劑量＞400 ng/mL 時，細胞增殖增加不明顯，說明HMGB1 對乳腺癌細胞增殖的促進作用不具有劑量依賴性。采用細胞劃痕試驗檢測外源HMGB1 刺激后乳腺癌細胞的遷移，結(jié)果顯示，經(jīng)400 ng/mL 的HMGB1 處理48 h 后，細胞的遷移明顯增強（P＜0.01），且呈時間依賴性。采用Transwell 法檢測400 ng/mL 外源HMGB1 處理24 h 后MDAMB-453 細胞的穿膜數(shù)量，發(fā)現(xiàn)HMGB1 處理的加藥組細胞穿膜數(shù)量高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

綜上所述，研究結(jié)果表明HMGB1 在乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲方面起著促進作用，這一結(jié)果對乳腺癌的治療提供了新的思路。