韓中惠 王曉敏 張 燕 劉 冰 王 碩*

（1 齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院 濟南250353 2 天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院 食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室 天津300457 3 南開大學醫(yī)學院 天津市食品科學與健康重點實驗室 天津300071）

雜環(huán)胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）是富含蛋白質(zhì)的食物在熱加工過程中形成的具有多環(huán)芳香族結(jié)構(gòu)的致癌、致突變的一類化合物[1-2]。這些雜環(huán)胺具有增加罹患結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌和食道癌等疾病的風險[3-4]。鑒于雜環(huán)胺對健康的危害，研究者通過外源添加抑制劑以減少雜環(huán)胺的形成。目前研究表明，多酚類化合物[5]、維生素[6]、金屬陽離子[7]和酰胺類化合物[8]等物質(zhì)都能顯著減少食品中雜環(huán)胺的含量。

研究人員發(fā)現(xiàn)，不同種類的糖可有效降低雜環(huán)胺中2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4，5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo [4，5-b]pyridine，PhIP）的形成[9-11]。本課題組前期研究揭示了糖抑制PhIP 形成的可能作用機制，糖（葡萄糖、果糖和乳糖等）可通過熱降解形成α-二羰基化合物（丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮等），而α-二羰基化合物可分別與PhIP 的前體物發(fā)生相應的化學反應形成新的產(chǎn)物，或者直接與PhIP反應形成新的產(chǎn)物，從而減少食品體系中PhIP 的含量[12]。從食品安全的角度考慮，這些新形成的產(chǎn)物是否安全，決定了PhIP 減控后食品的安全性，因此，針對新產(chǎn)物毒理學性質(zhì)的研究具有重要意義。然而，由于加工食品組分的復雜性，對大量制備新產(chǎn)物進行毒理學評價的動物實驗提出了巨大挑戰(zhàn)，因此借助計算機軟件模擬預測新產(chǎn)物的毒性，十分必要。

Discovery Studio 中的TOPKAT 模塊軟件可以通過對化學物質(zhì)結(jié)構(gòu)參數(shù)的計算，預測小分子化合物的毒性。TOPKAT 模塊軟件目前主要用于藥物設(shè)計研發(fā)中復雜成分的毒性預測以及市售藥品中的微量成分的毒性預測。美國食品和藥物管理局（Food and drug administration，F(xiàn)DA）和加拿大藥品評審委員會均利用這類數(shù)據(jù)庫幫助判斷相關(guān)化合物的毒性[13]。與傳統(tǒng)的毒理學試驗相比，采用TOPKAT 模塊軟件進行毒性預測具有分析速度快，成本低，不依賴試驗條件等優(yōu)點。TOPKAT 模塊軟件預測數(shù)據(jù)的準確率超過85%[14]。本研究采用Discovery Studio （TOPKAT） 軟件，對糖抑制PhIP 形成過程中產(chǎn)生的相關(guān)新產(chǎn)物進行毒性預測，為全面評價PhIP 減控后的食品安全提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及設(shè)備

ChemDraw 12.0 軟件，美國Cambridge Soft 公司；Discovery Studio 分析軟件，美國BIOVIA 公司；Precision T7810 工作站，美國Dell 公司。

1.2 毒性計算方法

用ChemDraw 12.0 軟件繪制相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)式，生成Discovery Studio（TOPKAT）軟件可以識別的格式（sdf 格式）；將化合物結(jié)構(gòu)式導入Discovery Studio 軟件，生成分子二維（2D）結(jié)構(gòu)；選擇要分析的化合物結(jié)構(gòu)式，再選擇相關(guān)的毒理學評價指標后進行分析[15]。本研究選擇的毒理學評價指標為致突變性（Ames test）、潛在發(fā)育毒性、大鼠口服半致死量（Median lethal dose，LD50）、大鼠吸入半致死濃度（Median lethal concentration，LC50）、大鼠長期口服最低毒副反應水平和大鼠皮膚致敏性。

1.3 預測結(jié)果的分析判定

致突變性（Ames test）、潛在發(fā)育毒性（DTP）和皮膚致敏性的預測結(jié)果為概率值，當預測值為0.000～0.300 時，被預測的化合物具有毒性的概率低，且可能會在實際測定中產(chǎn)生陰性結(jié)果；當預測值大于0.300 或小于0.700 時，被預測的化合物所具有的毒性不確定；當預測值大于0.700 時，被預測的化合物具有毒性的概率高，且可能會在實際測定中產(chǎn)生陽性結(jié)果[16]。大鼠口服LD50毒性范圍的定義為：LD50>15 g/kg，無毒性；5 g/kg

2 結(jié)果與分析

2.1 糖抑制PhIP 形成過程中的新產(chǎn)物

食品體系中的糖抑制PhIP 的形成，可以通過糖形成的活性中間體α-二羰基化合物中的丙酮醛分別與形成PhIP 的前體物肌酐或PhIP 發(fā)生反應，形成新化合物[12]。糖在抑制PhIP 形成的過程中還會形成其它的α-二羰基化合物，例如：乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮。由于α-二羰基化合物是一類具有類似化學性質(zhì)的物質(zhì)，根據(jù)它們新產(chǎn)生化合物的反應形成機理，乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮也可分別與肌酐（如圖1）或PhIP（如圖2）發(fā)生反應生成相應的新化合物。圖1中α-二羰基化合物的活性基團羰基與肌酐的活性基團亞甲基或與氨基分別通過羥醛縮合和羰胺縮合反應形成相應的反應產(chǎn)物。圖2是α-二羰基化合物的活性基團羰基與PhIP 的活性基團亞甲基發(fā)生羰胺縮合反應形成相應的產(chǎn)物。

圖1 乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮與肌酐反應產(chǎn)物的形成Fig.1 Formation of the reaction products of glyoxal，diacetyl and 3-deoxyglucosone with creatinine

圖2 乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮與PhIP 反應產(chǎn)物的形成Fig.2 Formation of the reaction products of glyoxal，diacetyl and 3-deoxyglucosone with PhIP

2.2 新產(chǎn)物的毒理性質(zhì)預測

采用Discovery Studio（TOPKAT）軟件分別對丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮與肌酐或PhIP 反應形成相應新化合物的毒理學數(shù)據(jù)進行預測，并與PhIP 的毒理學數(shù)據(jù)進行比較分析。

表1顯示了PhIP 的相關(guān)毒性預測結(jié)果，PhIP致突變性的預測數(shù)值為1.000，說明PhIP 具有較高的致突變性，與PhIP 的毒理學實驗數(shù)據(jù)報道一致[18]，說明對于該化合物的毒性預測準確。PhIP 潛在發(fā)育毒性的預測數(shù)值為0.000，表明PhIP 不具有潛在發(fā)育毒性。大鼠口服PhIP 的LD50值為9.5 mg/kg，屬于毒性范圍。PhIP 對于大鼠吸入LC50和大鼠長期口服最低毒副反應水平最小量分別為859.1 mg/kg 和43.2 mg/kg。PhIP 使皮膚致敏性的結(jié)果為0.000，表明不具有使皮膚致敏的可能性。

表1 PhIP 的相關(guān)毒性Table 1 Related toxicity of PhIP

表2顯示了丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮與肌酐由羥醛縮合和羰胺縮合反應途徑形成相關(guān)產(chǎn)物的毒理學評價指標數(shù)據(jù)。從表中可以看出這8 種產(chǎn)物致突變性和潛在發(fā)育毒性的數(shù)值均為1.000，這表明它們致突變性和潛在發(fā)育毒性的結(jié)果均呈陽性，這些產(chǎn)物致突變性的結(jié)果與PhIP 致突變性的結(jié)果相同，沒有發(fā)生變化，而它們的潛在發(fā)育毒性與PhIP 相比毒性增強。這8種產(chǎn)物的大鼠口服LD50值分別在輕度毒性、實際無毒性和無毒性的范圍，它們均比PhIP 的大鼠口服LD50量低，表明這些產(chǎn)物半致死量的毒性比PhIP 弱；其中3-脫氧葡萄醛酮和肌酐經(jīng)羥醛縮合反應途徑形成產(chǎn)物的半致死量值最大為85.6 g/kg，表明該產(chǎn)物在大鼠口服LD50評價中表現(xiàn)的毒性最小。在大鼠吸入LC50的評價指標中，這8 種產(chǎn)物的半致死濃度均比PhIP 的859.1 g/m3·H 低，表明8 種產(chǎn)物在這個評價指標中的毒性均比PhIP強。這些產(chǎn)物（除丙酮醛和肌酐經(jīng)羰胺縮合反應途徑形成的產(chǎn)物外） 的大鼠長期口服最低毒副反應水平的量均比PhIP 小，表明除個別產(chǎn)物外，大部分產(chǎn)物的形成使它的毒性增強。在皮膚致敏性的評價指標中，通過數(shù)據(jù)分析表明這些反應產(chǎn)物不具有使皮膚致敏的可能性，與對PhIP 預測的結(jié)果相同，雖然3-脫氧葡萄醛酮和肌酐經(jīng)羥醛縮合途徑形成的產(chǎn)物使皮膚致敏性的預測結(jié)果為0.255，但是該值仍處在不具有致敏性的范圍內(nèi)。此外，在致突變性、潛在發(fā)育毒性、大鼠吸入LC50和大鼠皮膚致敏性這4 個毒理學評價指標中，經(jīng)羥醛縮合和羰胺縮合途徑形成產(chǎn)物的毒性分別與PhIP 對比結(jié)果都一致，這表明在一定程度上這些產(chǎn)物之間的毒性性質(zhì)相似。

表2 反應產(chǎn)物（肌酐與α-二羰基化合物）的相關(guān)毒性Table 2 Related toxicity of reaction product （creatinine and α-dicarbonyl compounds）

α-二羰基化合物（丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮）與PhIP 的4 種反應產(chǎn)物的相關(guān)預測毒性結(jié)果見表3，結(jié)果顯示α-二羰基化合物與PhIP 反應產(chǎn)物致突變性的結(jié)果為陽性，這與預測PhIP 致突變性的結(jié)果相同，表明致突變的毒性沒有發(fā)生變化。對這4 種反應產(chǎn)物的潛在發(fā)育毒性和皮膚致敏性預測的結(jié)果均為陰性，這與PhIP的結(jié)果相同，表明潛在發(fā)育和皮膚致敏的毒性也沒有發(fā)生變化。這4 種產(chǎn)物的大鼠口服LD50（mg/kg）量分別為16.2，20.0，16.4，275.9 mg/kg，此結(jié)果明顯高于PhIP（9.5 mg/kg）的LD50量，說明相比PhIP 來說，這4 種產(chǎn)物的毒性降低，然而還在毒性或中度毒性范圍內(nèi)，其中PhIP 與3-脫氧葡萄糖醛酮的產(chǎn)物毒性最小。在大鼠吸入LC50方面，這些產(chǎn)物（除PhIP 與乙二醛反應產(chǎn)物）表現(xiàn)出的毒性均比PhIP 低。然而，這4 種產(chǎn)物的大鼠長期口服最低毒副反應水平量均高于PhIP，說明在大鼠長期口服最低毒副反應水平上表現(xiàn)出毒性降低現(xiàn)象。

表3 反應產(chǎn)物（PhIP 與α-二羰基化合物）的相關(guān)毒性Table 3 Related toxicity of reaction product （PhIP and α-dicarbonyl compounds）

3 討論

通過TOPKAT 軟件預測分析表明，在致突變性（Ames test）評價中，α-二羰基化合物與肌酐的反應產(chǎn)物和α-二羰基化合物與PhIP 的反應產(chǎn)物結(jié)果相同，均具有致突變毒性，與PhIP 所具有的毒性相比沒有發(fā)生變化；在潛在發(fā)育毒性評價中，α-二羰基化合物與肌酐的反應產(chǎn)物所具有的毒性與PhIP 相比增強，而α-二羰基化合物與PhIP 的反應產(chǎn)物與PhIP 的結(jié)果相同，毒性沒有發(fā)生改變；在大鼠口服LD50和大鼠長期口服最低毒副反應水平評價中，絕大部分α-二羰基化合物與肌酐反應產(chǎn)物的毒性均比PhIP 強，而α-二羰基化合物與PhIP 的反應產(chǎn)物所表現(xiàn)的毒性比PhIP 弱；在大鼠吸入LC50評價中，大部分產(chǎn)物的毒性均比PhIP 的毒性強；在皮膚致敏性評價指標中，α-二羰基化合物與肌酐的反應產(chǎn)物和α-二羰基化合物與PhIP 的反應產(chǎn)物均不具有皮膚致敏毒性。從這3 種反應途徑形成的產(chǎn)物來看，每個途徑形成產(chǎn)物之間的結(jié)果與PhIP 對比的結(jié)果整體一致，說明在一定程度上這一類的化合物毒理學性質(zhì)相似。其毒理學性質(zhì)相似可能是α-二羰基化合物與于肌酐/PhIP 形成產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)決定的，不同途徑形成產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)具有較多的相同官能團，所以使同一途徑形成的產(chǎn)物具有類似的活性。

綜合以上分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖抑制PhIP 產(chǎn)生過程中的新化合物仍存在不同程度的毒性。盡管糖可以抑制雜環(huán)胺PhIP 的產(chǎn)生，減少雜環(huán)胺本身的危害，然而由于伴隨產(chǎn)物的危害仍存在，并不能完全保障整體食品的安全性。對糖抑制雜環(huán)胺PhIP產(chǎn)生過程中新產(chǎn)物的毒性研究結(jié)果僅為其毒理學特性評價提供依據(jù)，要準確評價新產(chǎn)物的毒理性質(zhì)，仍需全面系統(tǒng)的進行毒理學實驗評估。