郗夢(mèng)露 張興吉 葛武鵬

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科與工程學(xué)院 陜西咸陽712100）

我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品產(chǎn)區(qū)主要集中在甘肅、青海、新疆、西藏以及內(nèi)蒙古等地，其特殊的地理氣候環(huán)境以及牧民的生活習(xí)慣造就了獨(dú)特的微生物資源[1-3]。生活在牧區(qū)的牧民利用豐富的乳品資源，以馬乳、牛乳、駱駝乳和羊乳等為原料，通過傳統(tǒng)的發(fā)酵方式制成酸牦牛奶、酸馬奶、酸駝奶、奶渣等乳制品[4-5]。在發(fā)酵乳品制作過程中，伴隨著以乳酸菌為主的微生物生長(zhǎng)代謝活動(dòng)[6]。相關(guān)研究表明，長(zhǎng)期飲用酸馬奶、酸駝奶等乳酸菌發(fā)酵制品可以降低人體內(nèi)血清膽固醇的含量，降低人體患心血管疾病、肥胖等風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。從不同牧區(qū)發(fā)酵乳中篩選出具有開發(fā)應(yīng)用潛力的乳酸菌，是從大自然獲取可利用資源的有效方式之一。

近年來，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們的生活節(jié)奏不斷加快，不良生活習(xí)慣的人群比例越來越高，從而導(dǎo)致患冠心病、高血脂和高血壓等心血管疾病的人群日益增多[9]。人體內(nèi)血清膽固醇含量高是誘發(fā)心血管疾病的重要原因[10]。大量研究發(fā)現(xiàn)，部分乳酸菌具有降低人體內(nèi)血清膽固醇的能力，關(guān)鍵在于其生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生膽鹽水解酶的活力優(yōu)劣（Bile salt hydrolase，BSH）[11]。膽鹽水解酶在機(jī)體內(nèi)可將結(jié)合態(tài)膽鹽分解為游離膽鹽和相應(yīng)的氨基酸產(chǎn)物，在酸性條件下，游離膽鹽和膽固醇發(fā)生共沉淀效應(yīng)；亦或是結(jié)合態(tài)膽鹽，經(jīng)膽鹽水解酶分解后生成的游離膽汁酸不利于腸道吸收，被排出體外，導(dǎo)致其在腸肝系統(tǒng)循環(huán)中的膽汁酸量減少，肝臟利用膽固醇重新合成膽汁酸，加速了膽固醇的分解代謝，因此膽鹽水解酶被認(rèn)為是降解膽固醇的關(guān)鍵因素[12-16]。如郭春鋒等[17]對(duì)乳酸菌降解膽固醇的可能機(jī)理進(jìn)行探究，結(jié)果表明：在體外具有膽鹽解離能力的乳酸菌，在體內(nèi)亦具有潛在的降解膽固醇能力。γ-氨基丁酸（GABA）作為一類非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于自然界中，是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)起重要作用，參與體內(nèi)的代謝與生理功能的正常表達(dá)。

現(xiàn)有研究中，還沒有對(duì)青海、甘肅、新疆、西藏和內(nèi)蒙古等5 個(gè)西部牧區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中乳酸菌的膽鹽解離能力的比較分析。本文綜合分析上述五大西部牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中乳酸菌膽鹽解離能力，探究篩選出的優(yōu)良乳酸菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力，為乳酸菌新資源發(fā)掘，以及γ-氨基丁酸工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，也為西部牧區(qū)微生物新資源的開發(fā)及合理化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源 分離自青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、西藏牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品（酸牦牛奶、酸馬奶、酸駝奶和奶渣）的275 株乳酸菌。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 培養(yǎng)基：MRS 肉湯培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限公司。

試劑：乙腈、乙酸乙酯，美國(guó)TEDIA 有限公司；甘氨膽酸鈉（GCA）、甘氨脫氧膽酸鈉（GDCA）、甘氨鵝脫氧膽酸鈉（GCDCA）、牛磺膽酸鈉（TCA）、?；敲撗跄懰徕c （TDCA）、?；蛆Z脫氧膽酸鈉（TCDCA）、脫氧膽酸鈉標(biāo)品、甲酸、磷酸、2，4-對(duì)溴苯乙酮、N，N-二異丙基乙胺，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；MD200-1 氮吹儀，山東萊索科技有限公司；DRP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；YXQ-LS-50SII-01-00 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HC3018 型高速離心機(jī)，安徽科大中佳有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌膽鹽解離能力定性分析 將待測(cè)菌株接種至MRS 肉湯培養(yǎng)基中于37 ℃活化2 代后，以體積分?jǐn)?shù)1%的量接種到2 mL 含有0.4 mmol/L GDCA 和TDCA 的MRS 肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

待測(cè)菌株培養(yǎng)24 h 后，向培養(yǎng)基中加入甲酸，調(diào)節(jié)pH 值至2.0，混勻，再向培養(yǎng)基中加入6 mL 乙酸乙酯，混勻，室溫靜置20 min，于8 000×g離心5 min，取3 mL 上清液于氮吹管，50 ℃氮?dú)獯蹈?，然后?.5 mL 4.5 g/L 2，4-對(duì)溴苯乙酮的乙腈-甲醇（體積比9∶1）溶液進(jìn)行復(fù)溶，向氮吹管中加入23 μL N，N-二異丙基乙胺溶液，60 ℃水浴30 min，水浴結(jié)束后將溶液混勻冷卻至25 ℃室溫，取1 mL 溶液經(jīng)0.45 μm 尼龍膜過濾，利用高效液相色譜法對(duì)溶液中的膽酸鈉進(jìn)行分析。本試驗(yàn)以不接菌的含GDCA 和TDCA 的MRS 肉湯培養(yǎng)基作為空白對(duì)照[18]。

高效液相色譜條件：色譜柱為安捷倫TC-C18（25 cm×0.46 cm×5 μm）；流動(dòng)相A 為乙腈-水（70∶30，體積比，磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.1）；流動(dòng)相B 為乙腈。梯度洗脫：流動(dòng)相A 首先運(yùn)行5 min，然后流動(dòng)相B 在25 min 內(nèi)由0%升高到80%，維持15 min。樣品進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)器波長(zhǎng)為254 nm。

1.3.2 乳酸菌膽鹽解離能力定量分析 對(duì)275 株乳酸菌進(jìn)行膽鹽解離能力定性分析，篩選出具有膽鹽解離能力的陽性株，并對(duì)陽性株的膽鹽解離能力進(jìn)行定量分析。

將待測(cè)陽性株接種至MRS 肉湯培養(yǎng)基中于37 ℃活化2 代后，以體積分?jǐn)?shù)1%的量接種到2 mL 含有0.4 mmol/L GCA，GDCA，GCDCA，TCA，TDCA，TCDCA 的MRS 肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

待測(cè)菌株培養(yǎng)24 h 后，向培養(yǎng)基中加入2 mL 甲醇終止反應(yīng)，用1 mol/L NaOH 溶液將培養(yǎng)基pH 值調(diào)至6.0，混勻，于8 000×g 離心5 min，取1.0 mL 上清液經(jīng)0.45 μm 尼龍膜過濾，利用高效液相色譜法對(duì)溶液中的膽鹽進(jìn)行分析。本試驗(yàn)以不接菌的含TCA，TDCA，TCDCA，GCA，GDCA，GCDCA 的MRS 肉湯培養(yǎng)基作為空白對(duì)照[19]。

高效液相色譜條件：色譜柱為安捷倫TC-C18（25 cm×0.46 cm×5 μm）；流動(dòng)相A 為含0.0075 mol/L 四丁基硫酸氫銨的乙腈-水溶液（體積比60∶40）；流動(dòng)相B 為含0.0075 mol/L 四丁基硫酸氫銨的乙腈-水溶液（體積比30∶70）。梯度洗脫：流動(dòng)相B 的比例在30 min 內(nèi)由85%下降至30%，然后在1 min 內(nèi)上升至85%，維持9 min。樣品進(jìn)樣量為40 μL，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)器波長(zhǎng)200 nm。

待測(cè)菌株膽鹽解離能力評(píng)價(jià)基于菌株培養(yǎng)基中TCA，TDCA，TCDCA，GCA，GDCA，GCDCA 的降解率按式（1）計(jì)算。

式中，C0——不接種菌株的含0.4 mmol/L TCA，TDCA，TCDCA，GCA，GDCA，GCDCA 的MRS肉湯培養(yǎng)基中各膽鹽的濃度（mmol/L）；C1——待測(cè)樣品培養(yǎng)基中TCA，TDCA，TCDCA，GCA，GDCA，GCDCA 各膽鹽的濃度（mmol/L）。

1.3.3 乳酸菌產(chǎn)γ-氨基丁酸能力分析 將篩選出的優(yōu)勢(shì)膽鹽解離能力的乳酸菌陽性株于50 mmol/L L-谷氨酸鈉的MRS 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)12，24，36，48 h 后，置于離心機(jī)中8 000×g 離心10 min。取100 μL 上清液于5 mL 具塞試管中，向具塞試管中加入0.45 mL 40 g/L NaHCO3溶液，充分混勻，加入0.5 mL 5 g/L 衍生試劑丹磺酰氯（用丙酮溶解丹酰氯，配制得到丹磺酰氯），充分混勻，60 ℃水浴反應(yīng)30 min，水浴結(jié)束后加入100 μL 氨水，充分混勻，60 ℃水浴反應(yīng)5 min 以終止衍生反應(yīng)，水浴結(jié)束后加入1 mL 甲醇，振蕩混勻，取1 mL 上層溶液經(jīng)0.45 μm 尼龍膜過濾，通過高效液相色譜法測(cè)定溶液中的γ-氨基丁酸含量。本試驗(yàn)空白對(duì)照為不接菌的含有50 mmol/L L-谷氨酸鈉的MRS 肉湯培養(yǎng)基，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

高效液相色譜條件：色譜柱為安捷倫TC-C18（25 cm×0.46 cm×5 μm）；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相A 為四氫呋喃-甲醇-三水合乙酸鈉溶液（三水合乙酸鈉濃度為0.05 mol/L，磷酸調(diào)節(jié)pH 值至6.2，流動(dòng)相A 中各溶液體積比為10∶150∶840）；流動(dòng)相B 為甲醇。梯度洗脫為流動(dòng)相B，在0～25 min內(nèi)，從10%升高到45%，維持2 min，然后從27 min 到28 min 升高到90%，維持5 min，然后在1 min 內(nèi)降到10%，維持7 min。梯度洗脫程序持續(xù)41 min，樣品進(jìn)樣量15 μL，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)254 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3 次，使用SPSS 19.0 和Excel 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽鹽解離能力陽性株篩選

對(duì)275 株乳酸菌膽鹽解離能力進(jìn)行定性分析，篩選出83 株具有膽鹽解離能力的乳酸菌，分為12 個(gè)乳酸菌種，分別分離自青海酸牦牛奶、新疆酸馬奶、內(nèi)蒙古酸馬奶、新疆酸駝奶和西藏奶渣樣品。具有膽鹽解離能力乳酸菌菌株信息如表1所示。

表1 解離膽鹽陽性株分布情況Table 1 The information of bile salt deconjugation ability strains

（續(xù)表1）

在23 種乳酸菌中，有12 種乳酸菌具有膽鹽解離能力，分別為瑞士乳桿菌（Lb.helveticus）、植物乳桿菌 （Lb.plantarum）、副干酪乳桿菌（Lb.paracasei）、德式乳桿菌保加利亞亞種 （Lb.delbrueckii ssp.Bulgaricus）、干酪乳桿菌（Lb.casei）、發(fā)酵乳桿菌（Lb.fermentum）、短乳桿菌（Lb.breris）、開菲爾乳桿菌（Lb.kefiri）、假腸膜明串珠菌（Leuc.pseudomesenteroides）、堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（Ec.durans）、屎腸球菌（Ec.faecium）、戊糖片球菌（P.pentosaceus）。在275 株乳酸菌中不同菌種之間陽性株篩出率存在差異，瑞士乳桿菌陽性株篩出率為4%，副干酪乳桿菌陽性株篩出率為95%，植物乳桿菌陽性株篩出率為90.5%，屎腸球菌陽性株篩出率為100%，德式乳桿菌保加利亞亞種陽性株篩出率為26.3%，干酪乳桿菌陽性株篩出率為82.4%，短乳桿菌陽性株篩出率為100%，發(fā)酵乳桿菌陽性株篩出率為15.4%，開菲爾乳桿菌陽性株篩出率為25%，假腸膜明串珠菌陽性株篩出率為33.3%，堅(jiān)強(qiáng)腸球菌陽性株篩出率為66.6%，戊糖片球菌陽性株篩出率為100%，故副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌和戊糖片球菌呈現(xiàn)出較高的陽性株篩出率。本研究的篩選結(jié)果與先前研究相一致，根據(jù)之前的文獻(xiàn)報(bào)道顯示，乳桿菌、腸球菌以及片球菌均具有膽鹽水解酶合成能力[20-24]。

不同地區(qū)、不同傳統(tǒng)發(fā)酵乳品分離出的乳酸菌中，陽性株篩出率存在差異。地區(qū)間比較結(jié)果顯示，青海地區(qū)、甘肅地區(qū)、新疆地區(qū)、內(nèi)蒙古地區(qū)、西藏地區(qū)分離出的乳酸菌中陽性株篩出率分別為18.2%，0，17.8%，7.9%，78.9%，故西藏地區(qū)分離出的乳酸菌中陽性株篩出率最高，而甘肅地區(qū)分離出的乳酸菌中未篩選出陽性株。發(fā)酵乳品品種間比較結(jié)果顯示，酸牦牛奶、酸馬奶、酸駝奶、奶渣分離出的乳酸菌中陽性株篩出率為15.4%，8.1%，14.3%，75.7%，故奶渣分離出的乳酸菌中陽性株篩出率最高，而酸馬奶分離出的乳酸菌中陽性株篩出率最低。導(dǎo)致上述差異的原因可能與乳種成分之間的差異、菌種的聚類、當(dāng)?shù)鬲?dú)特的地理氣候環(huán)境、發(fā)酵乳的制作工藝以及采樣點(diǎn)的不同有關(guān)。

2.2 陽性乳酸菌膽鹽解離能力定量分析

2.2.1 陽性株對(duì)6 種膽鹽解離能力比較 將篩選出的陽性株對(duì)6 種膽鹽的解離率進(jìn)行方差分析，比較陽性株對(duì)6 種膽鹽解離能力的差異。

圖1 83 株陽性菌對(duì)6 種膽鹽解離能力比較Fig.1 The comparison of six human bile salts deconjugation rate for 83 BSH-positive LAB

結(jié)果如圖1所示，陽性株對(duì)6 種膽鹽解離能力存在顯著性差異（P<0.05），其中對(duì)GDCA 的解離率最高，對(duì)TDCA 的解離率最低。同時(shí)陽性株對(duì)GDCA 和GCDCA 的解離能力差異不顯著（P>0.05），對(duì)TCA，TDCA 和TCDCA 的解離能力差異不顯著（P>0.05），對(duì)GDCA 和GCDCA 的解離能力顯著高于GCA，TCA，TDCA 和TCDCA （P<0.05），對(duì)GCA 的解離能力顯著高于TCA，TDCA 和TCDCA（P<0.05）。綜上可知，陽性乳酸菌對(duì)甘氨酸結(jié)合態(tài)膽鹽的解離能力高于?；撬峤Y(jié)合態(tài)膽鹽。Mcauliffe 等[25]研究表明嗜酸乳桿菌NCFM 中含有bshA 和bshB 兩個(gè)膽鹽水解酶基因，而這兩種基因?qū)?yīng)合成的膽鹽水解酶對(duì)結(jié)合態(tài)膽鹽降解偏好不同，故導(dǎo)致上述差異的原因可能是乳源中篩分出的陽性株，所含膽鹽水解酶基因表達(dá)出的膽鹽水解酶對(duì)甘氨酸結(jié)合態(tài)膽鹽的解離能力高于牛磺酸結(jié)合態(tài)膽鹽所致。

2.2.2 不同地區(qū)發(fā)酵乳品中陽性株膽鹽解離能力比較 將青海、新疆、內(nèi)蒙古、西藏4 個(gè)地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中篩分出陽性株的膽鹽解離率進(jìn)行方差分析，比較不同地區(qū)陽性株在膽鹽解離能力上的差異。

結(jié)果如圖2所示，不同地區(qū)陽性株膽鹽解離能力存在顯著性差異（P<0.05）。從總膽鹽解離結(jié)果分析可知，來源于西藏和新疆的陽性株解離能力顯著高于青海和內(nèi)蒙古的陽性株 （P<0.05），尤其以來源于新疆地區(qū)的陽性株對(duì)總膽鹽解離能力最強(qiáng)，內(nèi)蒙古地區(qū)的陽性株解離能力最差。分別從6 種膽鹽解離結(jié)果分析可知，4 個(gè)地區(qū)的陽性株分別對(duì)TCA，TDCA 和TCDCA 的解離能力差異不顯著（P>0.05），然而對(duì)GCA，GDCA 和GCDCA 的解離能力各自呈顯著性差異（P<0.05）。來源于新疆的陽性株對(duì)GCA 和GCDCA 的解離能力顯著高于青海與內(nèi)蒙古的陽性株（P<0.05）；來源于西藏的陽性株對(duì)GCA 和GCDCA 的解離能力顯著高于內(nèi)蒙古的陽性株（P<0.05），而與新疆和青海的陽性株解離能力差異不顯著（P>0.05）；來源于新疆的陽性株對(duì)GDCA 的解離能力顯著高于青海與內(nèi)蒙古的陽性株 （P<0.05）；來源于西藏的陽性株對(duì)GDCA 的解離能力顯著高于青海的陽性株（P<0.05），而與新疆和內(nèi)蒙古的陽性株解離能力差異不顯著（P>0.05）。不同地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳品由于當(dāng)?shù)鬲?dú)特的地理氣候環(huán)境，使其存在著復(fù)雜多樣的菌群微生態(tài)結(jié)構(gòu)以及特定的微生物類群，發(fā)酵乳品體系中的菌群之間存在互生現(xiàn)象，使得不同發(fā)酵乳品中乳酸菌的豐度存在差異，從而可能導(dǎo)致乳酸菌膽鹽解離能力的不同。乳酸菌的遺傳多樣性與其分離地區(qū)之間也存在直接關(guān)系，研究表明，每個(gè)地區(qū)乳酸菌均有屬于其獨(dú)特的基因型，從而解釋了乳酸菌解離膽鹽特性因地區(qū)不同而存在差異的推論[26]。

圖2 不同地區(qū)陽性株膽鹽解離能力比較Fig.2 Comparison of bile salt dissociation ability of positive strains in different regions

2.2.3 不同發(fā)酵乳品中陽性株膽鹽解離能力比較 將酸牦牛奶、酸馬奶和奶渣3 種傳統(tǒng)發(fā)酵乳品篩分出陽性株的膽鹽解離率進(jìn)行方差分析，分析不同傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中陽性株在膽鹽解離能力上的差異。

結(jié)果如圖3所示，不同傳統(tǒng)發(fā)酵乳品篩分出的陽性株膽鹽解離能力存在顯著性差異 （P<0.05）。從總膽鹽解離結(jié)果分析可知，奶渣中的陽性株解離能力顯著高于酸牦牛奶中的陽性株（P<0.05），酸馬奶中的陽性株解離能力與酸牦牛奶和奶渣中的陽性株無顯著性差異（P>0.05），其中奶渣中的陽性株對(duì)總膽鹽解離能力最強(qiáng)，酸牦牛奶中的陽性株解離能力最差。從6 種膽鹽解離結(jié)果分析可知，來源于3 種傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的陽性株對(duì)GCA，TCA，TDCA 和TCDCA 的解離能力差異不顯著（P>0.05），對(duì)GDCA 和GCDCA 的解離能力呈顯著性差異 （P<0.05）。來源于奶渣中的陽性株對(duì)GCDCA 的解離能力顯著高于酸牦牛奶中的陽性株（P<0.05），而來源于酸馬奶中的陽性株對(duì)GCDCA 解離能力與酸牦牛奶和奶渣中的陽性株無顯著性差異（P>0.05）；來源于酸馬奶和奶渣中的陽性株對(duì)GDCA 解離能力顯著高于酸牦牛奶中的陽性株（P<0.05）。不同傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中乳酸菌膽鹽解離能力存在差異，可能由于不同物種之間各自生存條件、牧民的喂養(yǎng)方式以及生長(zhǎng)環(huán)境不同，導(dǎo)致其乳中干物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分存在差異，使得乳中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)和所表達(dá)出的膽鹽解離能力不同。Sun 等[27]采用多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）技術(shù)對(duì)分離自我國(guó)和蒙古國(guó)的瑞士乳桿菌遺傳多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，指出菌株的聚類與乳源有關(guān)，即酸馬奶、酸牛奶和酸牦牛奶中分離出的乳酸菌形成單獨(dú)的類群使其菌株的特性存在普遍的差異；Song 等[26]利用MLST 技術(shù)對(duì)中國(guó)、俄羅斯及蒙古國(guó)等地的傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中德式乳桿菌保加利亞亞種進(jìn)行微進(jìn)化分析，研究證實(shí)了乳酸菌會(huì)因?yàn)檫m應(yīng)其所處環(huán)境而發(fā)生某種特定進(jìn)化的假說，顯示出分離菌株為適應(yīng)特定的生存環(huán)境而發(fā)生某種進(jìn)化的歷程。除此之外，乳的發(fā)酵前處理以及發(fā)酵乳的制作方式不同也會(huì)導(dǎo)致乳酸菌膽鹽解離能力的差異。

圖3 不同發(fā)酵乳品中陽性株膽鹽解離能力比較Fig.3 Comparison of bile salt dissociation ability of positive strains in different fermented dairy products

2.2.4 不同種類優(yōu)勢(shì)陽性株膽鹽解離能力比較 對(duì)4 種優(yōu)勢(shì)陽性乳酸菌的膽鹽解離率進(jìn)行方差分析，分析不同優(yōu)勢(shì)陽性菌種在膽鹽解離能力上的差異。

結(jié)果如圖4所示，4 種不同優(yōu)勢(shì)陽性菌種之間膽鹽解離能力存在顯著性差異（P<0.05）。從總膽鹽解離結(jié)果分析可知，植物乳桿菌和短乳桿菌的膽鹽解離能力顯著高于副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌（P<0.05），短乳桿菌對(duì)總膽鹽解離能力最強(qiáng)，干酪乳桿菌解離能力最差。從6 種膽鹽解離結(jié)果分析可知，4 種陽性菌種分別對(duì)TCA 和TCDCA 的解離能力差異不顯著（P>0.05），然而對(duì)GCA，GDCA，TDCA 和GCDCA 的解離能力呈顯著性差異（P<0.05）。植物乳桿菌和短乳桿菌對(duì)GDCA 和GCDCA 的解離能力顯著高于副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌（P<0.05）；短乳桿菌對(duì)GCA 的解離能力顯著高于植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌（P<0.05），植物乳桿菌對(duì)GCA 的解離能力顯著高于副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌（P<0.05）；短乳桿菌和副干酪乳桿菌對(duì)TDCA 的解離能力顯著高于干酪乳桿菌（P<0.05），而植物乳桿菌對(duì)TDCA的解離能力與短乳桿菌、副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌差異不顯著（P>0.05）。不同菌種在膽鹽解離能力上的差異可能由于菌種自身所具有的特性間存在相互影響，不同種類乳酸菌產(chǎn)膽鹽水解酶能力不同，導(dǎo)致其膽鹽解離能力存在差異；不同種類乳酸菌在基因水平上的不穩(wěn)定性以及其表達(dá)出膽鹽水解酶活力的不穩(wěn)定，都可能導(dǎo)致其膽鹽解離能力不同。除此之外，不同種類乳酸菌自身所攜帶的膽鹽水解酶基因具有明顯差異，研究表明嗜酸乳桿菌 NCFM 中含有bshA 和bshB 兩個(gè)膽鹽水解酶基因，而植物乳桿菌中含有bsh1，bsh2，bsh3，bsh4 共4 個(gè)膽鹽水解酶基因[28-30]，不同基因所表達(dá)出的膽鹽水解酶活性存在差異，表現(xiàn)出對(duì)6 種膽鹽的解離能力不同，故不同菌種間所含膽鹽水解酶基因的不同也是導(dǎo)致其膽鹽解離能力差異的原因之一。

圖4 不同種類優(yōu)勢(shì)陽性株膽鹽解離能力比較Fig.4 Comparison of bile salt dissociation ability of different dominant positive strains

2.2.5 對(duì)篩選出不同優(yōu)勢(shì)陽性株產(chǎn)γ-氨基丁酸能力研究 對(duì)篩選出4 種優(yōu)勢(shì)陽性乳酸菌的產(chǎn)γ-氨基丁酸能力進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定，通過結(jié)果分析不同優(yōu)勢(shì)陽性菌種在產(chǎn)γ-氨基丁酸能力上的差異。

表2 乳酸菌的γ-氨基丁酸產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果（mmol/L）Table 2 Determination of γ-aminobutyric acid production of lactic acid bacteria （mmol/L）

由表2可知，優(yōu)勢(shì)陽性株的γ-氨基丁酸的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，在培養(yǎng)48 h后產(chǎn)量達(dá)到峰值。4 種陽性菌中γ-氨基丁酸的產(chǎn)量最高為新疆酸馬奶的植物乳桿菌，產(chǎn)量達(dá)（3.4±0.2）mmol/L，其次為西藏奶渣中的短乳桿菌，產(chǎn)量為（0.7±0.02）mmol/L，而副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌不能產(chǎn)γ-氨基丁酸。乳酸菌具備產(chǎn)γ-氨基丁酸能力主要因其在生長(zhǎng)代謝過程中，會(huì)產(chǎn)生谷氨酸脫羧酶與谷氨酸發(fā)生催化脫羧反應(yīng)產(chǎn)生γ-氨基丁酸，故不同乳酸菌種之間產(chǎn)谷氨酸脫羧酶能力不同，也可導(dǎo)致其產(chǎn)量的差異；不同來源的乳酸菌因其地區(qū)、乳源以及發(fā)酵乳品制作工藝的不同，使得菌種在基因表達(dá)方面上存在差異，從而導(dǎo)致菌株產(chǎn)量不同。

大量研究表明短乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌等均具有產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力，且產(chǎn)量較高。本研究中篩選出的植物乳桿菌產(chǎn)γ-氨基丁酸能力相比于其它純培養(yǎng)條件下處于較高水平。Di等[31]從干酪中分離出一株植物乳桿菌，在MRS 純培養(yǎng)條件下，γ-氨基丁酸的產(chǎn)量為498.1 mg/L。本試驗(yàn)篩選出4 種優(yōu)良菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸能力分析：短乳桿菌和植物乳桿菌有較高產(chǎn)γ-氨基丁酸能力，而副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌不產(chǎn)γ-氨基丁酸，同時(shí)基于本實(shí)驗(yàn)室之前的研究發(fā)現(xiàn)[32]，短乳桿菌和植物乳桿菌呈優(yōu)勢(shì)膽鹽解離能力、高產(chǎn)γ-氨基丁酸能力的同時(shí)也具備高降解亞硝酸鹽能力，可進(jìn)行下一步性能研究[33]，為優(yōu)良乳酸菌種資源的開發(fā)提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

1）從275 株乳酸菌中篩選出83 株具有膽鹽解離能力的乳酸菌，分為12 個(gè)乳酸菌種，分離自青海酸牦牛奶、新疆酸馬奶、內(nèi)蒙古酸馬奶、新疆酸駝奶和西藏奶渣樣品。菌種中副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、屎腸球菌、戊糖片球菌和干酪乳桿菌呈現(xiàn)出較高的陽性株篩出率，菌株來源中西藏奶渣呈現(xiàn)出較高的陽性株篩出率。

2）陽性株對(duì)6 種結(jié)合態(tài)膽鹽的解離能力存在顯著性差異（P<0.05），其中對(duì)GDCA 解離率最高，對(duì)TDCA 解離率最低。陽性株對(duì)甘氨酸結(jié)合態(tài)膽鹽的解離能力高于?；撬峤Y(jié)合態(tài)膽鹽。

3）區(qū)域間比較顯示：不同地區(qū)陽性株對(duì)GCA，GCDCA，GDCA 和總膽鹽解離能力存在顯著性差異（P<0.05）；乳種間比較顯示：不同乳種陽性株對(duì)GCDCA，GDCA 和總膽鹽解離能力存在顯著性差異（P<0.05）；優(yōu)勢(shì)菌種間比較顯示：不同種類陽性株對(duì)GCA，GCDCA，GDCA，TDCA 和總膽鹽解離能力存在顯著性差異（P<0.05）。由此可見，膽鹽解離能力因菌株來源和種類不同存在差異性，以新疆酸馬奶、酸駝奶和西藏奶渣中的陽性株膽鹽解離能力表現(xiàn)最優(yōu)，其中短乳桿菌、植物乳桿菌顯示了較強(qiáng)的膽鹽解離能力。

4）4 種優(yōu)良膽鹽解離能力菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸能力分析：短乳桿菌和植物乳桿菌有較高產(chǎn)γ-氨基丁酸能力，而副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌不產(chǎn)γ-氨基丁酸。綜上所述，膽鹽解離能力因菌株來源和種類不同存在差異性，以新疆酸馬奶、酸駝奶和西藏奶渣中的陽性株膽鹽解離能力表現(xiàn)最優(yōu)，其中短乳桿菌、植物乳桿菌顯示了較強(qiáng)的膽鹽解離能力，同時(shí)具有高產(chǎn)γ-氨基丁酸能力，可為優(yōu)良乳酸菌種資源的開發(fā)提供理論依據(jù)。