景智波 田建軍* 趙麗華 張開屏 靳 燁

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品系 呼和浩特010070）

脂肪酶是一類可以在油相、水相中將三脂酰甘油酯水解釋放脂肪酸和甘油的生物酶類，又稱甘油酯水解酶，被廣泛應(yīng)用于奶制品、肉制品等食品的精細(xì)加工中[1-3]。動(dòng)物、植物和微生物都可產(chǎn)脂肪酶，其中微生物種類繁多，易于培養(yǎng)，可通過育種手段提高產(chǎn)酶量，且有比動(dòng)植物脂肪酶更廣的作用溫度、pH 和底物特異性[4-6]，因此，工業(yè)上普遍采用培養(yǎng)微生物生產(chǎn)脂肪酶，特別是在食品加工行業(yè)。大量研究表明，多數(shù)微生物都可產(chǎn)脂肪酶以消化脂質(zhì)，包括細(xì)菌28 個(gè)屬，放線菌4 個(gè)屬，酵母菌10 個(gè)屬，其它真菌23 個(gè)屬，共計(jì)65 個(gè)屬的微生物產(chǎn)脂肪酶[7-9]。2007年Bora 等[10]分析不同碳源對(duì)所分離的植物乳桿菌LBN4 產(chǎn)脂肪酶能力影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，橄欖油是誘導(dǎo)脂肪酶產(chǎn)生的重要碳源；2012年國外研究者Joseph 等[11]從冰川土壤樣品中分離到嗜冷性細(xì)菌脂肪酶產(chǎn)生菌——微黃桿菌的最適產(chǎn)酶條件為15 ℃，pH 8.0，且Mn2+，Cu2+會(huì)抑制菌體產(chǎn)酶；2014年郭威[12]采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)脂肪酶的枯草芽孢桿菌3EA1-1 的產(chǎn)酶條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH 8.0，培養(yǎng)12 h，10%的接種量且經(jīng)紫外誘變，其酶活力可提高到50.5 U/mL。張嬋等[13]從富油樣品中得到320 株產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌、酵母菌和霉菌，進(jìn)一步分離獲得1 株高產(chǎn)脂肪酶菌株，通過培養(yǎng)基優(yōu)化，其最終酶活力達(dá)到9.28 U/mL，較優(yōu)化前提高2.65 倍。

基于我國對(duì)微生物產(chǎn)脂肪酶的研究較晚，且主要集中于菌種的分離篩選，在實(shí)際工業(yè)化應(yīng)用中高產(chǎn)脂肪酶的微生物菌種十分有限，因此篩選具有活力高、產(chǎn)量高、成本低的脂肪酶，開發(fā)脂肪酶應(yīng)用新菌種十分必要。本試驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌菌株富集培養(yǎng)，初篩和復(fù)篩得到1 株產(chǎn)酶較高的目的菌株，通過單因素及Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件，得到酶活性較高的菌株。以此將該菌株作為進(jìn)一步育種的出發(fā)菌株，為深入研究該菌所產(chǎn)脂肪酶的性質(zhì)及應(yīng)用提供理論依據(jù)，為發(fā)酵食品行業(yè)提供優(yōu)良的菌株來源。

1 材料與方法

1.1 菌種

乳酸菌菌株，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品科學(xué)與技術(shù)團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室提供，共計(jì)55 株，分離自西藏風(fēng)干肉、巴盟中旗牛肉、羊肉樣品中。

1.2 培養(yǎng)基

1）TPY 培養(yǎng)基（液體）：胰蛋白胨8 g，植物蛋白胨8 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，K2HPO42 g，KH2PO43 g，MgCl2-6H2O 0.5 g，半胱氨酸-HCL 0.5 g，吐溫-80 1 mL，F(xiàn)eSO4-7H2O 10 mg，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5～6.8，121 ℃，滅菌20 min。

2）中性紅油脂平板：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，橄欖油聚乙烯醇乳化液120 mL，MgSO40.5 g，瓊脂15 g，1.6%中性紅溶液1 mL，pH 7.0～7.5，蒸餾水1 000 mL。

3）三丁酸甘油酯平板：A 液：Tris-HCl（pH 8.0 的緩沖液）；B 液：三丁酸甘油酯乳化液；A∶B=1∶9（體積比），瓊脂1.5%。

4）富集培養(yǎng)基：酵母膏2 g，橄欖油5 mL，K2HPO41 g，MgSO4-7H2O 0.1 g，硫酸銨1 g，NaCl 0.5 g，pH 7.0，121 ℃，20 min。

5）發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：硫酸銨1 g，硫酸鎂1 g，磷酸二氫鉀1 g，葡萄糖5 g，橄欖油乳化液12 mL，蛋白胨30 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃，20 min。

1.3 主要試劑與儀器

1.3.1 試劑 TPY 液體培養(yǎng)基成分、異丙醇、橄欖油，國藥試劑有限公司；聚乙烯醇，源葉生物試劑公司；三丁酸甘油酯，羅恩試劑公司；對(duì)硝基苯酚（P-NP），北京百靈威科技有限公司；Triton X-100、阿拉伯樹膠粉，索拉比試劑公司；DNA 試劑盒、蛋白酶K，天根試劑公司；Taq-DNA 聚合酶、dNTP MIX、DNA Marker、溶菌酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 儀器與設(shè)備 ZSB-1200IIA2 超凈工作臺(tái)，南京依貝儀器設(shè)備公司；HM-12 型pH 計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；ZSB-9272 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；HH-4 恒溫水浴鍋，上海福碼實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Eppendorf 高速冷凍離心機(jī)，艾本德中國有限公司；SYNERGY H1酶標(biāo)儀，雷康恒泰北京商貿(mào)有限公司；UV-180 紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選 中性紅平板變色法、三丁酸甘油酯透明圈法[13-15]：將供試菌株于TPY 液體培養(yǎng)基活化后接種于富集培養(yǎng)基中，37℃富集48 h，得到富集培養(yǎng)液。分別吸取各菌株富集液1 mL 涂布于中性紅油脂平板中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取平板變色菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，取2 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液，其中1 mL 經(jīng)10 000 r/min 離心10 min，獲取上清液，即酶液。在配制好的三丁酸甘油酯的平板中打0.8 cm的小孔，分別移取100 μL 離心上清液及未離心菌液于小孔內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)3～5 d 后，測(cè)定透明圈直徑，直徑越大其產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

1.4.2 脂肪酶活力的測(cè)定 采用對(duì)硝基苯酚（PNPP 法）[16-18]。

酶活單位定義：在35 ℃反應(yīng)條件下每分鐘脂肪酶分解底物4-棕櫚酸硝基苯酯（P-NPP）釋放出1 μmol 對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位U。

A 液：10 mol/L 的4-棕櫚酸硝基苯酯；B 液：50 mmol/L 的Tris-HCl（pH 8.0）的緩沖溶液；C 液：A 液與B 液以體積比1∶9 均勻混合，加入1%Triton X-100，0.1%阿拉伯樹膠粉，現(xiàn)用現(xiàn)配。

酶活測(cè)定：0.9 mL 的C 液 （37 ℃恒溫保溫5 min）+0.1 mL 稀釋酶液，37 ℃反 應(yīng)10 min，1 mL 95%乙醇終止反應(yīng)，測(cè)定OD410nm，以90 ℃水浴滅活酶液為對(duì)照。

對(duì)硝基苯酚濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取0.08346 g 對(duì)硝基苯酚（p-NP）用少量95%乙醇溶解，然后用水定容到100 mL，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為6 mmol/L，各取 0，2.5，5，7.5，10，15，20，30，40，50 μL p-NP 標(biāo)準(zhǔn)溶液于各試管內(nèi)，加入底物緩沖液為（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0），使得體系總體積為2 mL，并與95%乙醇按體積比2∶1 混勻，測(cè)定OD410nm處的吸光度值，繪制對(duì)硝基苯酚溶液濃度-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

式中，Y——對(duì)硝基苯酚濃度（μmol/L）；X——吸光度值（410 nm）。

1.4.3 菌種鑒定 采用天根生化科技公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組提取試劑盒，提取酶活性較高目的菌株TR1-1-3 的DNA 作模板，再利用16S rDNA 保守序列的通用引物27F 和1492R 作為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[19]，將擴(kuò)增產(chǎn)物送到上海美吉生物科技有限公司測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)，并利用MEGA 6.06 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.4 單因素發(fā)酵產(chǎn)酶條件試驗(yàn) 發(fā)酵培養(yǎng)基成分固定，選取菌株接種量，溫度、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、金屬離子等因素分析對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.4.4.1 接種量對(duì)菌株TR1-1-3 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響參照雷健美等[20]的方法略作修改：將菌株TR1-1-3 于TPY 液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)3 代后轉(zhuǎn)接于富集培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)后按0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%的接種量接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，測(cè)定不同組別下的酶活力，定義酶活最高值處的酶活力為100%，計(jì)算其余各處的相對(duì)酶活，以確定最適接種量。

1.4.4.2 培養(yǎng)溫度、pH 值對(duì)菌株TR1-1-3 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 將菌株TR1-1-3 的培養(yǎng)溫度分別控制在18，25，30，37，45 ℃下，并在最適溫度下調(diào)整發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的pH 值為5，6，7，8，9，分別發(fā)酵48 h 后按照1.4.2 節(jié)的方法測(cè)定不同培養(yǎng)溫度、pH 值下發(fā)酵上清液中的酶活力[21-22]，定義酶活最高值下的酶活力為100%，計(jì)算其余溫度，各pH 值下的相對(duì)酶活，以確定最佳培養(yǎng)溫度及pH值。

1.4.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株TR1-1-3 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 將產(chǎn)脂肪酶菌株TR1-1-3 接種于發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0，12，24，36，48，60，72 h，取各時(shí)間段下的發(fā)酵上清液按照1.4.2 節(jié)的方法進(jìn)行酶活測(cè)定[14]，定義酶活最高值處的酶活力為100%，計(jì)算其余各處的相對(duì)酶活，并測(cè)定各時(shí)間段下的菌株的生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酸情況，以確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.4.4.4 不同金屬離子對(duì)菌株TR1-1-3 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.4 g/L 的Fe2+，Mg2+，Ca2+，Cu2+，Mn2+，將目的菌株接種于上述培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h 后，測(cè)定發(fā)酵上清液中的酶活[23]，與未添加的任何金屬離子的體系做對(duì)照，且將未添加任何金屬離子的酶活定義為100%，計(jì)算其余金屬離子的相對(duì)酶活，分析金屬離子對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響。

1.4.5 Box-Behnken 優(yōu)化菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件 選取接種量、溫度、pH 值3 個(gè)因素作為自變量，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)建立3 因素3 水平試驗(yàn)，以脂肪酶酶活力為響應(yīng)值，確定最佳產(chǎn)酶條件。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 Box-Behnken 分析因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken analysis

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3 次平均值，圖表采用Origin 9.0繪制，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析采用Design-Expert 8.0.6 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效產(chǎn)酶菌株篩選

利用中性紅平板、三丁酸甘油酯透明圈、對(duì)硝基苯酚法測(cè)定實(shí)驗(yàn)室保藏菌株（55 株）脂肪酶活性，共篩選得到11 株產(chǎn)脂肪酶陽性菌株，具體的分離結(jié)果及酶活力見表2。

表2 產(chǎn)脂肪酶菌株的分離結(jié)果Table 2 Isolation results of lipase-producing strains

（續(xù)表2）

中性紅平板呈紅色說明菌株產(chǎn)生的脂肪酶可降解橄欖油類（C18）的長(zhǎng)鏈底物，且在三丁酸甘油酯的平板中產(chǎn)生較大的透明圈，亦可說明菌株又能降解三丁酸甘油酯類（C4）的中短鏈底物。由表2的分離結(jié)果可知，所有菌株均可分解橄欖油類的長(zhǎng)鏈底物及三丁酸甘油酯類的中短鏈底物，且離心后的透明圈直徑明顯大于未離心的透明圈直徑，可見脂肪酶存在于菌株發(fā)酵培養(yǎng)上清液中，且TR1-1-17，TR1-1-18 等菌株的HC 值較高，分別為9.38，8.88，而酶活力只有2.27，2.84 U/mL，RB4-1-5 的酶活力最高為10.17 U/mL，HC 值卻只有4.29，而TR1-1-3 菌株的HC 值（6.00）相對(duì)較大且酶活力（9.89 U/mL）較高，綜合上述結(jié)果，將TR1-1-3 菌株作為后續(xù)研究的目的菌株。

2.2 目的菌株分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)上海美吉生物科技有限公司測(cè)序得到完整16S rDNA 序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)，對(duì)該序列采用MEGA 6.06 軟件N-J 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

圖1 菌株TR1-1-3 基于16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain TR1-1-3 based on 16S rDNA gene sequences

由圖1可知，TR1-1-3 菌株與瑞士乳桿菌屬同屬于一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近，可歸屬于瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），且與瑞士乳桿菌ATCC 15009 同源性為99%。2015年何捷等[24]利用銅皂法從酸馬奶中篩選出產(chǎn)脂肪酶的植物乳桿菌RC4，同年張晶晶等[25]采用油脂平板法篩選出1株脂肪酶檸檬酸桿菌，而對(duì)于瑞士乳桿菌產(chǎn)脂肪酶這一菌屬鮮有報(bào)道。

2.3 單因素發(fā)酵產(chǎn)酶條件試驗(yàn)

2.3.1 接種量對(duì)菌株TR1-1-3 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響分別按照不同接種量接種于發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其酶活測(cè)定結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)接種量不同時(shí)，菌株TR1-1-3相對(duì)酶活力不同，且各組之間幾乎均存在顯著差異（P<0.05），將作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化因素之一。接種量為1.5%～2.5%時(shí)，試驗(yàn)菌株的相對(duì)酶活均高于其它試驗(yàn)組，且2%的接種量為最佳接種量。菌株的接種量會(huì)影響菌株在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力，接種量增大會(huì)提高菌株的生長(zhǎng)速度，而接種量過大會(huì)使培養(yǎng)基中容量減少，使培養(yǎng)基中的代謝廢物增加，進(jìn)而影響菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶能力。

2.3.2 培養(yǎng)溫度、pH 值對(duì)菌株TR1-1-3 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 不同溫度、pH 值的酶活測(cè)定結(jié)果見圖3。

圖2 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the enzyme activity of the strain

圖3 溫度、pH 值對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of temperature，pH value on the enzyme activity of the strain

由圖3a可知，不同溫度下菌株TR1-1-3 的相對(duì)酶活存在顯著差異（P<0.05），可見培養(yǎng)溫度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶影響較大，將此因素作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化因素之一。37 ℃時(shí)菌株相對(duì)酶活力最高為13.76 U/mL，且顯著高于其它試驗(yàn)組，當(dāng)溫度為30，45 ℃時(shí)，相對(duì)酶活分別為81.15%，68.48%，與37 ℃時(shí)的相對(duì)酶活相差近20%～30%。由圖3b可知，隨著初始培養(yǎng)基中pH 值的升高，脂肪酶相對(duì)酶活力逐漸上升。在pH 值為6 時(shí)，相對(duì)酶活最高，產(chǎn)酶能力最強(qiáng)；當(dāng)pH ＞6 時(shí)，相對(duì)酶活顯著下降；在pH 值為8 和9 時(shí)，相對(duì)酶活僅為48%左右。因此，pH 6 是菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH，即中性環(huán)境更利于菌株TR1-1-3 發(fā)酵產(chǎn)酶。此外，不同pH 值對(duì)菌株TR1-1-3 產(chǎn)酶的影響不同，且不同組別間存在顯著差異（P<0.05），可將其作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化因素之一。因此，菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)溫度為37 ℃，最適pH 值為6。

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株TR1-1-3 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 不同培養(yǎng)時(shí)間的酶活測(cè)定結(jié)果見圖4。由圖4a，4b 可知，培養(yǎng)0～24 h 時(shí)，pH 值從6.05 下降到3.38，此時(shí)菌株產(chǎn)酶能力不斷增強(qiáng)；培養(yǎng)24～48 h 時(shí)，培養(yǎng)基pH 值趨于平穩(wěn)且菌株生長(zhǎng)由對(duì)數(shù)期進(jìn)入穩(wěn)定期，而此時(shí)菌株產(chǎn)酶能力顯著增強(qiáng)（P<0.05），進(jìn)入急速增長(zhǎng)時(shí)期；培養(yǎng)48 h 時(shí)，相對(duì)酶活力達(dá)到峰值；48 h 之后菌株產(chǎn)酶能力顯著下降（P<0.05），分析可能是菌株已進(jìn)入衰亡期，生長(zhǎng)能力減弱，產(chǎn)酶能力下降，培養(yǎng)基已到達(dá)極限pH（3.11），較高的酸度同樣抑制菌株的產(chǎn)酶能力?？傮w而言，在12 h 與72 h，24 h 與60 h 這些試驗(yàn)組之間沒有顯著差異（P<0.05），因此不作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化因素。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the enzyme activity of the strain

2.3.4 不同金屬離子對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在培養(yǎng)基中分別添加不同的金屬離子，酶活測(cè)定結(jié)果見圖5。

由圖5可知，添加了Fe2+，Mn2+的相對(duì)酶活力均高于未添加的空白對(duì)照組，而添加Ca2+，Mg2+，Cu2+的菌株產(chǎn)酶能力低于對(duì)照組，可見Fe2+，Mn2+對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶活力有一定的激活作用，分析可能由于Fe2+，Mn2+是其脂肪酶的輔酶因子，可以促進(jìn)產(chǎn)酶，而Ca2+，Mg2+，Cu2+對(duì)其有不同程度的抑制作用，可能由于金屬離子占據(jù)了脂肪酶活性中心，改變了脂肪酶構(gòu)象所致。其中Fe2+，Mg2+的效果與趙興秀等[23]、劉晶等[26]的研究結(jié)果相反，這可能菌屬差異所致。由于不同菌屬的菌株對(duì)金屬離子的吸附性不同，因此后續(xù)金屬離子將不作為響應(yīng)面優(yōu)化的因素。

2.4 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對(duì)酶活性影響顯著的溫度、pH 值、接種量3 個(gè)因素，3 個(gè)水平，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)17 組試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

2.4.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到酶活力（Y）與溫度（A）、pH 值（B）和接種量（C）3 個(gè)因素的二次多元回歸模型為：

圖5 金屬離子對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of metal ions on the enzyme activity of the strain

Y=-21.57+0.44A+8.31B+0.17C+0.07AB+0.45AC+2.15BC-0.02A2-1.16B2-11.99C2

方程的決定系數(shù)R2=0.9812，說明該回歸方程的擬合度很好，可通過此方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，該模型P<0.01（極顯著），失擬項(xiàng)P > 0.05（不顯著），同時(shí)模型決定系數(shù)R2=0.9812，校正決定系數(shù)R2adj=0.957。以上分析表明模型擬合度很好，建立的模型可解釋98%的響應(yīng)值的變化，且試驗(yàn)誤差較小，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度相關(guān)性[27]，可利用此模型對(duì)酶活進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface central composite design and experimental results

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表4的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，因素一次項(xiàng)C 對(duì)酶活影響極顯著，A，B 對(duì)酶活影響不顯著；交互項(xiàng)AB，AC，BC 對(duì)酶活影響顯著，二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)酶活影響顯著；這說明試驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素對(duì)酶活的影響程度依次為：C>B>A，即接種量>pH 值>溫度。

2.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)交互作用分析 響應(yīng)面是各因素對(duì)響應(yīng)值影響所構(gòu)成的三維空間曲面圖，它可以直觀的反映出各個(gè)因素與響應(yīng)值的交互作用，提供一種形象的觀測(cè)響應(yīng)值和試驗(yàn)參數(shù)水平關(guān)系的方法[28]。等高線的形狀反映兩因素之間交互作用的顯著程度，等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，而等高線呈橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[29]。結(jié)果見圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)酶活力影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 Response surface stereo analysis of the interaction of various factors on enzyme activity

由圖6可知，酶活隨溫度、pH 值和接種量的升高而增大，達(dá)到各因素中心值后，酶活隨各因素升高而逐漸減小。對(duì)比各圖，各因素對(duì)響應(yīng)面的陡峭程度影響，由大到小依次為：C（接種量）>B（pH值）>A（溫度）。從圖6a可知，溫度與pH 值間的立體投影-等高線為橢圓形，因素的交互作用影響顯著；溫度與接種量的圖6b亦為橢圓形，因素的交互作用顯著；pH 值與接種量圖6c為橢圓形，交互作用顯著，這與方差分析結(jié)果一致。結(jié)果表明相應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)較好的反應(yīng)了溫度、pH 值、接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)所得結(jié)果及二次多項(xiàng)回歸方程，獲得了目的菌株TR1-1-3 的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件：溫度36.2 ℃，pH 5.84，接種量2%，此時(shí)的酶活力最高，產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)合實(shí)際情況，溫度設(shè)定為36 ℃，pH 5.84，接種量2%的條件下做3 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的試驗(yàn)結(jié)果平均值為10.92±0.54，與理論值（11.07）較為接近，擬合度較好，說明采用響應(yīng)面得到的發(fā)酵條件參數(shù)真實(shí)可信，具有很好的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

采用中性紅平板變色法、三丁酸甘油酯透明圈法及對(duì)硝基苯酚法篩選得到1 株酶活力較高目的菌株TR1-1-3，經(jīng)16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定為瑞士乳桿菌。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件。經(jīng)二次多元回歸模型方程計(jì)算可知，最適培養(yǎng)條件為：接種量2%，36 ℃，pH 5.84，發(fā)酵培養(yǎng)48 h 時(shí)，目標(biāo)菌株TR1-1-3 的酶活性最強(qiáng)為10.92 U/mL，較優(yōu)化前有所提高，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)分析值基本相符；此外，金屬離子Fe2+，Mn2+會(huì)激活菌體產(chǎn)酶，而Ca2+，Mg2+，Cu2+對(duì)其有不同程度的抑制作用。

通過Box-Behnken 響應(yīng)面分析可知，各因素對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響大小依次為接種量>初始pH 值>培養(yǎng)溫度，且接種量與pH 值，接種量與溫度，pH 值與溫度之間的交互作用對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶影響顯著。本試驗(yàn)所選目的菌株與工業(yè)用產(chǎn)脂肪酶菌株比較，該菌株的酶活力相對(duì)較低，有待通過相關(guān)誘變方法，基因克隆與表達(dá)等操作，進(jìn)一步提高產(chǎn)酶量，為該菌株的開發(fā)、應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。