萬瑞雪，陳靜思，別 嘉，蘇 婭，孟昱時

（1） 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南昆明 650032；2） 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南昆明 650101）

體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET） 技術(shù)的不斷進步使不孕癥患者的臨床妊娠率大大提高，但仍有部分女性在接受多次胚胎移植后仍為獲得臨床妊娠，反復(fù)種 植 失 敗 （recurrent implantation failure，RIF）現(xiàn)在是輔助生殖技術(shù)發(fā)展中遇到的難點問題，在輔助生殖助孕中RIF 發(fā)生率約為10 %[1-3]。目前RIF 的定義尚未統(tǒng)一，一種是至少2 次胚胎移植未獲得妊娠者，另一種是進行了至少3 次胚胎移植未獲得妊娠者，而現(xiàn)在僅2 次胚胎移植后未獲得妊娠者被大部分RIF 治療方法的實驗研究作為研究對象[4]。RIF 病因尚未明確，排除胚胎染色體異常外現(xiàn)已闡明的部分如淋巴細(xì)胞亞群比例和功能失調(diào)、母體中自身抗體、促炎因子濃度升高均可以影響子宮內(nèi)膜容受性和胚胎發(fā)育，使患者發(fā)生RIF。子宮動脈重鑄不足和血栓前狀態(tài)也一樣影響胚胎著床[5]。

近年來多項研究表明子宮內(nèi)膜炎性改變與女性不孕、反復(fù)流產(chǎn)患者存在相關(guān)性。慢性子宮內(nèi)膜炎（chronic endometrial，CE） 是指持續(xù)存在的子宮內(nèi)膜炎癥，一般人群中的CE 患病率現(xiàn)不明確，大概0.8%～27.1%，但在不孕患者中明顯升高，約2.8%～26.8%，在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中的發(fā)病率高達9.7%～67.6%[6-9]。但是探討CE 與RIF 的關(guān)系的研究并不多，根據(jù)其病理狀況可以考慮CE 和RIF 的發(fā)生可能有一定的聯(lián)系，因此，本研究旨在探討RIF 與子宮內(nèi)膜CD38、CD138 表達的相關(guān)性，從而探究RIF 的發(fā)生是否與CE 的存在相關(guān)性，為更全面的思考RIF 的病因和治療方案提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2017 年1 月1 日至2017 年12 月31 日在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF-ET多次種植失敗的患者72 例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：RIF 組為多次移植的胚胎數(shù)量≥10個或移植了至少兩次優(yōu)質(zhì)胚胎仍未獲妊娠患者，且年齡≤37 歲。對照組為男性因素不孕，第一周期行IVF-ET 獲得妊娠者，且年齡≤37 歲。所有患者均在IVF-ET 前一周期自愿接受宮腔鏡檢查并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn):影響胚胎著床的因素如輸卵管積水、生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)異常、自身免疫性疾病、卵巢功能不良、內(nèi)分泌疾病等。

1.2 子宮內(nèi)膜組織獲取

所有患者均在月經(jīng)干凈3～7 d，在常規(guī)消毒下刮取性宮腔鏡檢查并刮取子宮內(nèi)膜，排除宮腔粘連、內(nèi)膜息肉、縱隔子宮及其他解剖結(jié)構(gòu)異常。刮取的內(nèi)膜組織立即放入70%乙醇固定液中，24 h內(nèi)行常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，分別行HE 染色和S-P 免疫組化染色。

1.3 子宮內(nèi)膜組織學(xué)觀察及CD38、CD138 的測定

1.3.1 閱片觀察間質(zhì)細(xì)胞的CD38、CD138 染色是否陽性，并計數(shù)每個高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)。記錄：記錄所觀察的數(shù)據(jù)及患者子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)診斷。

1.3.2 CD38、CD138 陽性的判讀標(biāo)準(zhǔn)漿細(xì)胞胞膜在CD38、CD138 免疫組化染色后可顯示強陽性，胞質(zhì)染色后則顯示為弱陽性，視野下可見到細(xì)胞質(zhì)呈嗜堿性，染色質(zhì)粗，沿核膜呈輻射狀排列成車輪狀，核圓但偏于細(xì)胞一側(cè)。慢性子宮內(nèi)膜炎的診斷為每400 倍高倍鏡視野下，子宮內(nèi)膜間質(zhì)中見到5 個或以上典型的漿細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 軟件包進行，計量資料符合正態(tài)分布以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩獨立樣本t檢驗進行比較，計數(shù)資料用率表示，采用卡方檢驗比較，定性變量分布的比較采用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較RIF 組及對照組患者一般情況

兩組年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH、HCG 日內(nèi)膜厚度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1，具有可比性。

表1 RIF 組與對照組一般情況比較（）Tab.1 General characteristic’s comparison of RIF and control group （）

表1 RIF 組與對照組一般情況比較（）Tab.1 General characteristic’s comparison of RIF and control group （）

2.2 兩組患者宮腔鏡檢查及常規(guī)病理檢查的比較

在72 例RIF 患者中，有5 例宮腔鏡手術(shù)醫(yī)師在術(shù)中見內(nèi)膜間質(zhì)水腫伴充血，提示子宮內(nèi)膜炎可能；41 例對照組患者中有2 例術(shù)中可見內(nèi)膜水腫伴散在微小乳頭狀突起，提示子宮內(nèi)膜炎可能，兩組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者常規(guī)病理報告均提示增生期或分泌期子宮內(nèi)膜，未見異常病理報告。

2.3 子宮內(nèi)膜CD38、CD138 陽性表達率與不明原因RIF 的相關(guān)性

72 例RIF 患者中共41 例CD38 表達為陽性（占56.9%）；共42 人CD138 表達陽性（占58.3%）；共48 例CD38 或CD138 表達陽性（占66.7%）。41 例對照組患者中共15 例CD38 表達陽性（占36.6%）；共16 例CD138 表達陽性（占39.0%）；共18 例人CD38 或CD138 表達陽性（占43.9%）。RIF 組CD38 陽性表達率及CD138 陽性表達率均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；RIF 組CD38 或CD138 陽性表達率也高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 RIF 組與對照組子宮內(nèi)膜CD38、CD138 陽性表達率的比較［n（%）］Tab.2 Expression rate of endometrium CD38 and CD138 in RIF and control group ［n（%）］

2.4 子宮內(nèi)膜CD38、CD138 陽性表達率與不同種植失敗次數(shù)的相關(guān)性

RIF 患者中共37 例胚胎種植失敗2 次，其中共16 例CD38 表達陽性（占43.2%）；共17 例CD138 表達陽性（占45.9%）；共18 例CD38 或CD138 表達陽性（占48.6%）。胚胎種植失敗3 次的患者共24 例，其中共15 例CD38 表達陽性（占62.5%）；共17 例CD138 表達陽性（占70.8%）；共19 例CD38 或CD138 表達陽性（占79.2%）。種植失敗次數(shù)大于3 次的患者共11 例，其中10 例CD38 表達陽性（占90.9%）；8 例CD138 表達陽性（占72.7%）；共11 例CD38 或CD138 表達陽性（占100%）。

不同種植失敗次數(shù)患者組間比較，隨種植失敗次數(shù)增加CD38 及CD138 的陽性表達率也增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；同時隨種植失敗次數(shù)的增加CD38 或CD138 的陽性表達率也增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同種植失敗次數(shù)患者CD38、CD138 陽性表達率的比較［n（%）］Tab.3 Comparison of different time's implantation failure patients with CD38 and CD138 expression rate ［n（%）］

2.5 CD38、CD138 細(xì)胞表達量與不同胚胎種植失敗次數(shù)的相關(guān)性

對種植失敗2 次、3 次、＞3 次三個組的陽性細(xì)胞表達量分為＜100 個、100～300 個、＞300 個三個水平，行秩和檢驗顯示種植失敗次數(shù)越多CD38、CD138 陽性細(xì)胞表達量就越高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

采用秩和檢驗行3 組的組間比較，種植失敗大于3 次的CD38、CD138 陽性細(xì)胞表達量均高于種植失敗3 次組和種植失敗2 次組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05） ；種植失敗2 次與3 次間陽性細(xì)胞表達量不具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表4 不同種植失敗次數(shù)患者CD38、CD138 表達量的比較Tab.4 Comparison of expression level of CD38 and CD138 in patients with different time's implantation failur

3 討論

在IVF-ET 周期中RIF 的患病率約10%，但RIF 的定義現(xiàn)尚未統(tǒng)一，歐洲人類生殖和胚胎學(xué)在2005 年將RIF 定義為累積移植大于等于10 枚高質(zhì)量胚胎均未著床，或胚胎植入3 次以上為著床者；本研究中選擇了至少2 次胚胎移植，有優(yōu)質(zhì)胚胎而未獲得妊娠者作為研究對象。

現(xiàn)有的研究將RIF 的病因歸納為胚胎因素、免疫、代謝、凝血、子宮解剖結(jié)構(gòu)異常幾個方面[10]，排除母體免疫、凝血等問題后CE 引起的胚胎種植失敗近年來得到了生殖醫(yī)學(xué)專家的關(guān)注。子宮內(nèi)膜炎的主要發(fā)病原因是病原微生物感染，但急性子宮內(nèi)膜炎與CE 是不同的治病原體感染引起，現(xiàn)運用基因組學(xué)、微生物組學(xué)技術(shù)可以有效的檢測CE 的致病原體[11]。存在炎癥的子宮內(nèi)膜都有漿細(xì)胞浸潤和IgM、IgG 和IgA 抗體的分泌，這些炎性因子的存在改變子宮內(nèi)膜的免疫環(huán)境，從何產(chǎn)生的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)會殺滅精子并呈現(xiàn)出胚胎毒作用，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降，不利于胚胎的種植和發(fā)育。除此之外近期國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CE 也可能通過影響間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化從而影響胚胎植入[12]。因此早發(fā)現(xiàn)、早治療CE 對改善不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及RIF 患者的妊娠結(jié)局是有幫助的。

現(xiàn)國內(nèi)外學(xué)者對RIF 的病因研究多關(guān)注免疫、凝血等方面的因素，因CE 常無特異性的臨床表現(xiàn)，有時會忽略了CE 引起的RIF。本研究中在宮腔鏡檢查中及常規(guī)病檢HE 染色均顯示RIF 組與對照組患者間的異常率無統(tǒng)計學(xué)差異，可見單純在宮腔鏡檢查中依靠肉眼辨識及傳統(tǒng)HE 染色的方法無法提高CE 的檢出率。CE 在宮腔鏡下的表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜間質(zhì)水腫，可見＜1 mm 的微小息肉及局部或散在的內(nèi)膜充血[13]。CE 在HE 染色鏡下可見內(nèi)膜增多和擴張的血管，存在浸潤在間質(zhì)中的漿細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。但由于內(nèi)膜中白細(xì)胞的存在干擾及以及組織切片中細(xì)胞著色不足等原因，子宮內(nèi)膜間質(zhì)中的單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞在常規(guī)的HE染色中難以和漿細(xì)胞區(qū)分[14]。因此CE 的診斷需要尋找特異性高的標(biāo)志物。

目前大量研究表明CD38，CD138 是漿細(xì)胞中最特異性表達物。使用免疫組織化學(xué)染色檢測二者能大幅度提高漿細(xì)胞的檢出率，優(yōu)于傳統(tǒng)的HE染色[15]。因此子宮內(nèi)膜是否有炎性改變可以用CD38、CD138 免疫組化染色來檢測，最終提高CE的確診率[16]。但目前通過檢出漿細(xì)胞診斷CE 還不足夠為CE 的治療提供依據(jù)，同時進行微生物組學(xué)檢測可以確認(rèn)內(nèi)膜微生物群成分，有助于明確微生物對內(nèi)膜產(chǎn)生的免疫機制及導(dǎo)致CE 發(fā)生的機制，并對使用針對性的抗生素治療CE 起到指導(dǎo)作用[17]。

本研究通過CD38、CD138 細(xì)胞在RIF 患者子宮內(nèi)膜中的陽性表達，研究發(fā)生RIF 與子宮內(nèi)膜CD38、CD138 陽性表達的相關(guān)性，從而對RIF 與子宮內(nèi)膜炎性改變的關(guān)系進行探討。研究結(jié)果顯示對照組子宮內(nèi)膜中CD38、CD138 的陽性表達率低于RIF 組，并且在RIF 的患者中子宮內(nèi)膜CD38、CD138 的陽性表達率就越高種植失敗的次數(shù)也就越多。再比較RIF 組CD38、CD138 的陽性細(xì)胞表達量，結(jié)果顯示種植失敗＞3 次的患者陽性細(xì)胞表達量明顯高于種植失敗2 次和3 次的患者。由此說明子宮內(nèi)膜CD38、CD138 的陽性表達與RIF 的發(fā)生存在相關(guān)性，也從而證實了RIF 與CE有關(guān)，并且子宮內(nèi)膜炎性改變的程度越重則胚胎反復(fù)種植失敗的次數(shù)越多，即胚胎種植越難。

根據(jù)現(xiàn)有的研究可以證實CE 和RIF 的發(fā)生存在相關(guān)性，那么對存在CE 的RIF 患者進行治療后對助孕結(jié)局是否有改善呢? Cicinelli、Mettao[18]等根據(jù)子宮內(nèi)膜微生物的培養(yǎng)結(jié)果對伴有CE 的RIF 患者使用相應(yīng)抗生素進行單獨或聯(lián)合用藥治療，結(jié)果顯示使用抗生素治療1～3 個療程后治愈CE 的患者人數(shù)為28%、23%和25%，剩余25%患者產(chǎn)生耐藥?？股刂委熀笤俅涡行迈r胚胎移植的活產(chǎn)率治愈組（60.9%） 高于持續(xù)CE 組（13.3%）。Hartnett J[19]等對伴有CE 的RIF 患者使用多西環(huán)素治療后，免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)CD138 基質(zhì)中漿細(xì)胞清除率達70%，治愈組第一周期移植活產(chǎn)率32.8%，3 個累積移植周期活產(chǎn)率為38.8%?，F(xiàn)抗生素治療以及是治療CE 的一線方式，我中心現(xiàn)使用甲硝唑和地塞米松宮腔上藥聯(lián)合口服抗生素的治療方案對RIF 伴CE 的患者進行治療，本研究入組患者治療后第一周期胚胎移植臨床妊娠率為35.4%（17/48），因部分患者失訪及依從性較低未能統(tǒng)計活產(chǎn)率及累積妊娠率。除抗生素作為一線治療方式，部分臨床醫(yī)生使用中藥或聯(lián)合物理治療CE，也可以使RIF 及RSA 患者獲得理想的妊娠結(jié)局。

綜上所述，不明原因反復(fù)胚胎種植失敗與子宮內(nèi)膜CD38、CD138 的陽性表達具有相關(guān)性；且反復(fù)種植失敗次數(shù)越多，CD38、CD138 陽性表達率及細(xì)胞表達量就越高；對不明原因反復(fù)胚胎種植失敗的患者通過免疫組化染色檢測子宮內(nèi)膜CD38、CD138 的表達，有助于確診CE 引起的RIF。確診后使用抗生素同時聯(lián)合物理及中藥治療有利于改善RIF 患者的妊娠結(jié)局。但本研究樣本量有限，可能存在一定的局限性，今后還需要擴大樣本量進一步研究。