劉 韜 ，吳希軍，朱萬(wàn)蕓，陳建雯，陽(yáng) 敬，沈志強(qiáng)，劉 光，柴文英，陳 鵬

（1） 紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，云南紅河 661100；2） 五蓮縣康復(fù)醫(yī)院，山東日照 262300；3） 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500；4） 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，云南昆明 650032）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS） 作為一種慢性炎性疾病，是大多數(shù)心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，不穩(wěn)定的粥樣斑塊一旦破裂或者斑塊募集血小板等血細(xì)胞而形成血栓，則有可能導(dǎo)致缺血性心腦血管事件，也是最常見的死亡原因之一[1]。其復(fù)雜多階段性病理過(guò)程給臨床治療帶來(lái)了困難。有研究指出，Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）與動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程密切相關(guān)，其中TLR4 在人體冠狀動(dòng)脈斑塊中表達(dá)較為明顯[2]。TLR4 能夠識(shí)別細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 介導(dǎo)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與免疫應(yīng)答的啟動(dòng)過(guò)程，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展[3]。有研究表明，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的TLR4 主要與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，而靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的TLR4 更可能與感染性心肌病和充血性心力衰竭有關(guān)[4]。因此，TLR4 對(duì)AS 的發(fā)生起到了重要的作用。目前，AS 常用的化學(xué)治療藥物有他汀類、抗血板和抗血脂藥等，但預(yù)后不太理想，存在一定的不良反應(yīng)。因此，迫切需要尋找和開發(fā)療效確切、不良反應(yīng)較小的天然藥物。

Corilagin （結(jié)構(gòu)式見圖1） 作為一種多酚類化合物，可以從滇產(chǎn)特色植物藥苦味葉下珠中提取分離，不良反應(yīng)小，臨床應(yīng)用日趨廣泛[5]。本項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，Corilagin 可通過(guò)有效抑制中性粒細(xì)胞與血小板之間的相互作用、降低C 反應(yīng)蛋白（CRP） 和氧化低密度脂蛋白受體-1（LDL-1） 的表達(dá)、降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、影響細(xì)胞周期和增殖、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移等機(jī)理發(fā)揮抗AS 作用[5-8]。本研究擬復(fù)制家兔動(dòng)脈粥樣硬化模型和用ox-LDL 損傷人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），探討Corilagin 對(duì)TLR4 蛋白及mRNA 表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究抗AS 新型藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 Corilagin 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of corilagin

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

Corilagin 由中科院昆明植物研究所提供，分子式為C27H22O18，純度99%，分子量634.5，無(wú)臭、黃褐色粉末。辛伐他汀，上海信宜萬(wàn)象藥業(yè)有限公司提供，純度＞99%，分子量418.6。維生素E 原粉購(gòu)于Sigma 公司，避光干燥保存。

高脂飼料：84.5%基礎(chǔ)飼料中加入10%豬油，4%蛋黃粉，1.5%膽固醇，本實(shí)驗(yàn)室配制。Ox-LDL，廣州奕源生物科技有限公司。胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基屬美國(guó)Gibco 公司產(chǎn)品。Golden Taq PCR 試劑盒，TRNzol-A+總RNA 提取試劑裂解液和BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒均屬天根生化科技（北京） 有限公司產(chǎn)品；TLR4 和β-actin 一抗及二抗羊抗兔均從美國(guó)Abmart 公司購(gòu)得；Purelink TM基因組DNA 小量提取試劑盒，Superscript III cDNA合成試劑盒，引物，Platinum SYBR Green qPCR 試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；膠片購(gòu)自柯達(dá)公司，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的發(fā)光底物屬Thermo 公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

清潔級(jí)新西蘭白兔，雌雄各半，體重1.8～2.2 kg，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，合格證號(hào)：SCXK（滇） 2005-0008。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC） 系購(gòu)自中國(guó)典型物保藏中心（Cell Line Designation:HUV-EC-C ATCC Catalog No.CRL-1730），本次實(shí)驗(yàn)選擇生長(zhǎng)良好的4-8 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 主要儀器

蛋白定量?jī)x（德國(guó)Thermo 公司）、垂直電泳儀和Mini Protein-3 型膜轉(zhuǎn)印裝置（美國(guó)Bio-rad 公司），WD-9405 型水平脫色搖床，WH-986 型靜音混合儀（北京六一儀器廠），Leica RM2135 切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司），全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad 公司）；核酸定量?jī)x（德國(guó)Thermo 公司），TPC-0220G 型PCR 擴(kuò)增儀，7500 型熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及高脂喂養(yǎng)致家兔AS 模型將家兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、2.5 mg/kg辛伐他丁陽(yáng)性對(duì)照組、1 mg/kg、2 mg/kg 和4 mg/kg Corilagin 組，10 只/組。

動(dòng)物均分籠單只飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。正常對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不做任何處理；其余各實(shí)驗(yàn)組飼喂高脂飼料，自由飲水。12 周后，每組各抽取2 只動(dòng)物處死，取主動(dòng)脈血管進(jìn)行病理學(xué)檢查。顯微鏡下可見增厚的血管內(nèi)膜，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列不整齊、不連續(xù)，血管平滑肌細(xì)胞大量遷移至血管內(nèi)膜并見泡沫細(xì)胞，病理學(xué)結(jié)果提示家兔AS 模型復(fù)制成功。

1.4.2 細(xì)胞分組及ox-LDL 誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞模型復(fù)制選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVEC 制備細(xì)胞懸液，通過(guò)計(jì)數(shù)調(diào)整上述細(xì)胞濃度到1×106mL/L，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)24 h，觀察HUVEC 生長(zhǎng)情況。用無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基替換完全培養(yǎng)基，同化HUVECs 24 h 后作為備用細(xì)胞。將上述細(xì)胞分成9 組，即正常對(duì)照組；模型組；10 μmol/L Vit E 組、1 μmol/L 辛伐他汀組；3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L 的Corilagin 藥物組（終濃度）。同化后棄培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)基，并分別加入相應(yīng)濃度的陽(yáng)性藥及Corilagin，孵育24 h，除正常對(duì)照組外其余組HUVECs 細(xì)胞中加入終濃度為70 mg/L 的ox-LDL 10 μL 刺激12 h，復(fù)制損傷模型。每組設(shè)6 個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.3 Q-PCR 方法測(cè)定家兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 的mRNA 表達(dá)利用蛋白酶消化液收集HUVEC 細(xì)胞；研缽中裝有液氮，將各組主動(dòng)脈斑塊組織研磨成粉末?？俁NA 提取使用Trizol 一步法。純度檢測(cè)和定量后取1 μg RNA，cDNA 的獲得可采用Superscript III cDNA 合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，以2 μL 的cDNA 為模板，SYBR Green II 染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系：上下游引物（0.2 μmol/L） 各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，含2×AllinOneTM Q-PCR Mix 10 μL。Ct 值采用Rotor-Gene 6.1.0.81軟件進(jìn)行分析檢測(cè)。5'-3'PCR 引物：TLR4 目的基因，上游CCATTTTATGTCATTTTCTT，下游GCTATCTGTGAGCGTGTATC；β-actin 內(nèi)參，上游引物TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下 游 引 物GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC。各樣本的內(nèi)參基因和TLR4 目的基因均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，并計(jì)算Ct平均值。本研究基因的表達(dá)變化采用△△Ct 相對(duì)定量法進(jìn)行。使用相對(duì)定量法表示目的基因TLR4的拷貝數(shù)，內(nèi)參基因先進(jìn)行標(biāo)化，先后獲得對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的目的基因、內(nèi)參基因的CT 值，△CT（1） ＝（實(shí)驗(yàn)組目的基因CT 值－實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因CT 值）；△CT（2） ＝（對(duì)照組目的基因CT 值－對(duì)照組參考基因CT 值）；△△CT＝△CT（1）－△CT（2）。實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)相對(duì)定量用2-△△CT表示，得到TLR4 基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4 Western Blot 方法測(cè)定家兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 的蛋白表達(dá) 將各組血管斑塊組織剪碎后放入裝有液氮的冷研缽中，充分研磨，然后加入300 mL 單去污劑裂解液（含PMSF） 于冰浴中裂解提取HUVEC 總蛋白質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)曲線以牛血清白蛋白制作，蛋白濃度采用BCA 法檢測(cè)。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)模、封閉后分別加入TLR4 一抗和β-actin 內(nèi)參，于洗膜后再用二抗羊抗兔進(jìn)行孵育。試劑激發(fā)熒光用Western blot 檢測(cè)，顯示于X 光片，顯影、掃描，系統(tǒng)成像經(jīng)數(shù)碼凝膠圖像定量分析、條帶的灰度值經(jīng)條帶密度掃描檢測(cè)。內(nèi)參為同管β-actin，計(jì)算目的蛋白TLR4 的相對(duì)表達(dá)量（TLR4 目的基因/ 內(nèi)參β-actin）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Corilagin 對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TLR4蛋白及mRNA 表達(dá)的影響

2.1.1 Corilagin 對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TLR4 mRNA 表達(dá)的影響從圖2 顯示，18 S 與28 S 兩個(gè)條帶清晰可見，28 S 亮度大約是18 S 的兩倍，膠上無(wú)其它大分子條帶；說(shuō)明總RNA 提取完整，無(wú)大分子物質(zhì)的污染，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。

Q-PCR 結(jié)果顯示，高脂飼料喂養(yǎng)造模后，模型對(duì)照組胸主動(dòng)脈斑塊TLR4 mRNA 表達(dá)水平明顯升高，與正常對(duì)照組比較P＜0.05。1、2 和4 mg/kg 劑量的Corilagin 與2.5 mg/kg 辛伐他汀均明顯降低胸主動(dòng)脈斑塊TLR4 mRNA 的表達(dá)水平，與模型組比較，P＜0.05，見表1。

圖2 總RNA 提取完整性檢驗(yàn)Fig.2 The extraction integrity test of total RNA

表1 Corilagin 對(duì)家兔AS 斑塊中TLR4 mRNA 表達(dá)的影響（）Tab.1 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

表1 Corilagin 對(duì)家兔AS 斑塊中TLR4 mRNA 表達(dá)的影響（）Tab.1 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，▲P＜0.05。

2.1.2 Corilagin 對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TLR4蛋白表達(dá)的影響高脂飼料喂養(yǎng)造模后，模型對(duì)照組斑塊TLR4 蛋白表達(dá)水平明顯升高，與正常對(duì)照組比較，P＜0.05。1、2 和4 mg/kg 劑量的Corilagin 與2.5 mg/kg 辛伐他汀均能明顯降低斑塊TLR4 蛋白的表達(dá)水平，與模型組比較，P＜0.05，見圖3，表2。

圖3 AS 斑塊中TLR4 蛋白表達(dá)水平Fig.3 The expression level of TLR4 protein 1:正常對(duì)照組；2:2.5 mg/kg 辛伐他汀組；3～5:4、2 和1 mg/kg 的Corilagin 組；6:模型對(duì)照組。

表2 Corilagin 對(duì)家兔AS 斑塊中TLR4 蛋白表達(dá)的影響（）Tab.2 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

表2 Corilagin 對(duì)家兔AS 斑塊中TLR4 蛋白表達(dá)的影響（）Tab.2 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，▲P＜0.05。

2.2 Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4蛋白及mRNA 表達(dá)的影響

2.2.1 Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 mRNA 表達(dá)的影響Q-PCR 結(jié)果顯示，用ox-LDL 培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC 24 h 后，與正常對(duì)照組比較，ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 mRNA 表達(dá)上調(diào)，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與ox-LDL 損傷模型組比較，用不同濃度Corilagin（3.125-25 μmol/L） 干預(yù)HUVEC 24 h 后，隨著Corilagin 濃度的升高其TLR4 的mRNA 表達(dá)量減少，與ox-LDL 損傷模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 mRNA表達(dá)的影響（）Tab.3 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in ox-LDL injured HUVEC （）

表3 Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 mRNA表達(dá)的影響（）Tab.3 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in ox-LDL injured HUVEC （）

與正常對(duì)照組比較，##P＜0.01；與ox-LDL 模型組比較，**P＜0.01。

2.2.2 Corilagin 對(duì)ox-LDL損傷的HUVEC 中TLR4 蛋白的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，ox-LDL 模型組的蛋白表達(dá)明顯提高（P＜0.05）；與ox-LDL 模型組比較，Corilagin 各組及陽(yáng)性對(duì)照藥1 μmol/L 辛伐他汀、10 μmol/L 維生素E能夠明顯抑制TLR4 蛋白表達(dá)（P＜0.05），且Corilagin 各組成量效關(guān)系抑制TLR4 蛋白表達(dá)（見圖4和表4）。

圖4 ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 蛋白表達(dá)水平Fig.4 The expression level of TLR4 protein in HUVEC injured by ox-LDL

表4 Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷HUVEC 中TLR4 蛋白表達(dá)的影響（灰度值） （）Tab.4 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in HUVEC injured by ox-LDL（）

表4 Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷HUVEC 中TLR4 蛋白表達(dá)的影響（灰度值） （）Tab.4 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in HUVEC injured by ox-LDL（）

與正常對(duì)照組比較，#P ＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

3 討論

心血管疾病是全世界最常見的死亡原因，到2030 年，死亡人數(shù)預(yù)計(jì)將達(dá)到3 000 萬(wàn)。AS 是心血管疾病的主要病因之一，全球每年約有2 000 萬(wàn)人死于AS[9]。目前，隨著調(diào)血脂、抗血小板和他汀類等藥物的使用，AS 病死率有所下降，但存在一定的不良反應(yīng)，預(yù)后不理想。因此，尋找和開發(fā)新的療效明確、不良反應(yīng)較小的天然藥物具有重要意義。有研究表明，Corilagin 具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值，例如，具有抗腫瘤、肝保護(hù)、抗炎等作用[10]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)了Corilagin 可影響HUVEC 和VSMC 的增殖和下調(diào)LOX-1 蛋白及mRNA 的表達(dá)，起到良好的抗AS 作用。然而Corilagin 對(duì)TLR4 基因的調(diào)控作用尚未有研究報(bào)道。因此，在本研究中，筆者探索了Corilagin 對(duì)AS 斑塊及ox-LDL 受損的HUVEC 中TLR4 蛋白和mRNA 表達(dá)影響，進(jìn)一步探索Corilagin 對(duì)AS 的作用機(jī)制，為深入研究抗AS 新型藥物提供科學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

TLR4 是一種炎癥因子，處于全身炎癥瀑布效應(yīng)的中間環(huán)節(jié)，主要通過(guò)髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88） 依賴型與非MyD88 依賴型通路參與炎性反應(yīng)。在MyD88 依賴通路中，TLR4 主要通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶MAPKs 導(dǎo)致炎性因子的產(chǎn)生和釋放[11]。該聯(lián)級(jí)反應(yīng)中涉及到很多關(guān)鍵因子，例如，絲/ 蘇氨酸白細(xì)胞介素-1 受體激酶I-RAKs、腫瘤壞死因子受體活化因子 6（TRAF-6）。在非MyD88 依賴型通路中，TLR4 可通過(guò)激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3） 和NF-κB 來(lái)釋放INF-1 和各種炎癥因子的產(chǎn)生和釋放[12]。有研究表明，在膿毒血癥小鼠模型上，Corilagin 可下調(diào)TLR4 表達(dá)抑制MyD88 依賴通路，從而減少炎癥反應(yīng)[2]。Yonekawa 等[13]提出TLR4 在破裂斑塊中的含量遠(yuǎn)高于外周血。有研究團(tuán)隊(duì)也在AS 病變動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上也檢測(cè)到TLR4 高表達(dá)[14]。除此之外，Katsargyris 和Michelsen 等[12]研究人員發(fā)現(xiàn)未使用他汀類藥物的患者TLR4 的表達(dá)水平明顯高于使用者，TLR4 基因缺陷的小鼠粥樣斑塊的形成比正常小鼠要小得多。同樣的，在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)高脂飼料喂養(yǎng)的模型對(duì)照組中TLR4 蛋白及mRNA的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組。ox-LDL 是影響動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，具有細(xì)胞毒性作用，可通過(guò)氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1） 上調(diào)血管轉(zhuǎn)錄基因，激活核轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多種炎癥因子和黏附分子的表達(dá)，從而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增生，使局部?jī)?nèi)膜出現(xiàn)粥樣斑塊[15]。本實(shí)驗(yàn)表明，Corilagin 能明顯抑制ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 蛋白和mRNA的表達(dá)（表3-6；圖3-6）。因此，Corilagin 對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與下調(diào)TLR4 表達(dá)量密切相關(guān)，但具體通過(guò)哪條通路影響TLR4 的表達(dá)尚需進(jìn)一步探索。