趙 煒，達(dá)林泰，尚 多

成釉細(xì)胞瘤(ameloblastoma,AM)是常見(jiàn)的牙源性腫瘤，具有局部侵襲性、復(fù)發(fā)性，少數(shù)發(fā)生惡變、轉(zhuǎn)移[1-3]。目前AM分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究主要集中于基因突變[4]、細(xì)胞增殖[5]、凋亡以及血管生成[6-7]、骨破壞機(jī)制[3]等方面，但確切機(jī)制仍未明確，了解AM的侵襲機(jī)制對(duì)探索新型治療方法具有重要意義。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)具有自我更新能力，維持著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[8]。AM中是否存在腫瘤干細(xì)胞，是否介導(dǎo)腫瘤的侵襲性目前尚不清楚。神經(jīng)嵴干細(xì)胞的標(biāo)志物P75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子低親和力受體(P75 neurotrophie factor receptor，P75NTR)可出現(xiàn)在牙發(fā)育各期[9]，參與神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等過(guò)程[10]，多種腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)均與P75NTR相關(guān)[11-12]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體介導(dǎo)的途徑在決定許多神經(jīng)外胚層來(lái)源的細(xì)胞的存活或凋亡時(shí)起關(guān)鍵作用，AM源自牙源性上皮，P75NTR表達(dá)于AM中[13-14]，但其是否與腫瘤的侵襲性相關(guān)尚不清楚。

腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2(SRY related HMG box gene 2)可以協(xié)同胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記物OCT4保持胚胎干細(xì)胞及成體祖細(xì)胞的多能性，可協(xié)同P75NTR調(diào)控上皮-間充質(zhì)相互作用[9]。在肝癌、食道癌、口腔癌、喉癌等多種腫瘤中，SOX2、P75NTR均被認(rèn)為是干細(xì)胞標(biāo)志物，對(duì)腫瘤細(xì)胞的干性維持和增殖起重要作用，且可促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]，其在AM中明顯表達(dá)[16]，但其在AM中是否有干細(xì)胞特性及參與腫瘤侵襲性，目前不是很清楚。本研究選擇各型AM病例28例，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)AM中SOX2、P75NTR的表達(dá)特點(diǎn)，探索AM中是否存在腫瘤干細(xì)胞及其是否參與腫瘤的侵襲性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月到2019年12月之間在本院口腔科住院手術(shù)治療的28例AM病例、5例含牙囊腫、5例牙源性角化囊腫，另以1例口腔鱗狀細(xì)胞癌、1例腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤病例(石蠟切片為病理科庫(kù)存的神經(jīng)外科手術(shù)標(biāo)本)作抗體表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)P75NTR、SOX2表達(dá)情況。收集AM病例患者男19例，女9例，年齡范圍在18～67歲，平均年齡41.2歲，上頜骨4例，下頜骨24例；實(shí)性型18例，單囊型10例。所有研究對(duì)象均符合內(nèi)蒙古自治區(qū)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到研究對(duì)象的知情同意。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

常規(guī)SP法免疫組化染色，滴加兔多克隆抗體P75NTR(艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司1∶150 ab52987)、SOX2(艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司1∶300 ab97959)室溫下孵育60 min；PBS沖洗3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶二抗，室溫孵育10 min。PBS漂洗3次，5 min/次；DAB顯色、蘇木素復(fù)染，PBS沖洗，氨水返藍(lán)，封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定方法

根據(jù)染色結(jié)果，SOX2在上皮細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá)呈現(xiàn)黃色為陽(yáng)性，P75NTR在上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)呈黃色為陽(yáng)性。每張切片選取5個(gè)200倍視野進(jìn)行結(jié)果判定，取平均值，所有切片均由2位病理醫(yī)師評(píng)估判定。記分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占上皮細(xì)胞總數(shù)的百分率<10%為陰性(-)，百分率在10%～25%之間為弱陽(yáng)性(+)，百分率在25%～50%之間為陽(yáng)性(++)，百分率>50%以上為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P75NTR的在各組織中的表達(dá)情況

不同標(biāo)記物在各組織中的表達(dá)情況見(jiàn)表1。①在實(shí)性型AM中，可見(jiàn)P75NTR不同程度陽(yáng)性表達(dá)，在濾泡型和叢狀型的周圍柱狀細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)，中央星網(wǎng)狀細(xì)胞弱表達(dá)(圖1b、2b)?；准?xì)胞型中上皮細(xì)胞均可見(jiàn)強(qiáng)表達(dá)(圖3b)。因?qū)嵭孕虯M中各病理亞型的生物學(xué)行為無(wú)明顯差異，且樣本量較小，故本文將濾泡型、叢狀型、基底細(xì)胞型等各亞型合并為實(shí)性型AM一并統(tǒng)計(jì)。②在單囊型AM中，P75NTR的表達(dá)方式不同，Ⅱ型與含牙囊腫、牙源性角化囊腫的表達(dá)類似，Ⅰ型、Ⅲ型與實(shí)性型的表達(dá)類似(圖4b)。P75NTR在實(shí)性型AM和單囊型AM中表達(dá)強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)。③在含牙囊腫(圖5b)和牙源性角化囊腫(圖6b)中，P75NTR在緊靠基底膜的上皮細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而遠(yuǎn)離基底膜的上皮細(xì)胞陰性表達(dá)，P75NTR在AM和含牙囊腫(P=0.041)及牙源性角化囊腫(P=0.03)中表達(dá)強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？谇击[狀細(xì)胞癌和腦膠質(zhì)瘤作為陽(yáng)性對(duì)照，均可見(jiàn)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)(圖7b、8b)。

表1 P75NTR、SOX2在各病種中的表達(dá)強(qiáng)度

2.2 SOX2的表達(dá)情況

28例AM中僅有9例上皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)(圖1a、2a、3a、4a)，5例含牙囊腫中有3例(圖5a)、5例牙源性角化囊腫中有4例(圖6a)上皮細(xì)胞不同程度陽(yáng)性表達(dá)。SOX2在實(shí)性型AM和單囊型AM中(P=0.759)、AM與含牙囊腫中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.207)。AM與角化囊腫中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045)。口腔鱗狀細(xì)胞癌和腦膠質(zhì)瘤作為陽(yáng)性對(duì)照，均可見(jiàn)細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)(圖7a、8a)。

a:SOX2表達(dá)陰性；b:P75NTR在周圍柱狀細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，中央星網(wǎng)狀細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)

a:SOX2在部分腫瘤上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)；b:P75NTR在外周柱狀細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，中央星網(wǎng)狀細(xì)胞表達(dá)較弱

a:SOX2陰性表達(dá)；b:P75NTR在整個(gè)上皮島細(xì)胞質(zhì)中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)

a:SOX2陰性表達(dá)；b:在緊鄰基底膜柱狀上皮細(xì)胞胞膜、胞漿P75NTR強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，遠(yuǎn)離基底膜上皮細(xì)胞陰性表達(dá)

a:SOX2在上皮細(xì)胞核強(qiáng)表達(dá)；b:P75NTR在緊鄰基底膜的上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，遠(yuǎn)離基底膜上皮細(xì)胞陰性表達(dá)

a:SOX2在上皮細(xì)胞核弱表達(dá)；b:P75NTR在緊鄰基底膜的上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，遠(yuǎn)離基底膜上皮細(xì)胞陰性表達(dá)

a:SOX2在細(xì)胞核強(qiáng)表達(dá)；b:P75NTR在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)

a:SOX2在細(xì)胞核強(qiáng)表達(dá)；b:P75NTR在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)

3 討 論

成釉細(xì)胞瘤(AM)是一種具有侵襲性的牙源性腫瘤[17]，目前AM的確切侵襲機(jī)制尚未明確，了解AM的侵襲機(jī)制對(duì)探索新型治療方法具有重要意義。本文通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)記物P75NTR、SOX2在AM中的表達(dá)情況，探索AM中是否存在腫瘤干細(xì)胞及其與AM侵襲性的相關(guān)性。

腫瘤干細(xì)胞是實(shí)體惡性腫瘤中存在的特定細(xì)胞亞群，其對(duì)腫瘤不受控制的增殖起重要作用，對(duì)介導(dǎo)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及療效等方面起至關(guān)重要的作用[18]。因此治療腫瘤的關(guān)鍵是要將這些對(duì)腫瘤持久增殖起重要作用的、特定的細(xì)胞亞群根除[19]，如何準(zhǔn)確定位并分離鑒定出CSCs是根治惡性腫瘤急需解決的問(wèn)題，然而目前CSCs缺乏特異性標(biāo)志物[20-24]。

P75NTR出現(xiàn)在牙齒發(fā)育的各個(gè)時(shí)期[9]，可以作為細(xì)胞標(biāo)記物來(lái)純化顱神經(jīng)嵴來(lái)源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞[25]，通過(guò)上皮-間充質(zhì)的相互作用，在成牙、礦化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[25]。P75NTR也參與神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等過(guò)程[10]，且P75NTR與多種腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)[11]。

Sathi對(duì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、CD44、ABCG2和細(xì)胞增殖活性標(biāo)志物Ki-67在AM中的表達(dá)情況分析，發(fā)現(xiàn)各標(biāo)志物在上皮島周圍柱狀細(xì)胞中均有表達(dá)，表明陽(yáng)性表達(dá)的外周柱狀細(xì)胞對(duì)于維持細(xì)胞的增殖活性有重要作用[26]，推測(cè)AM中周圍柱狀細(xì)胞維持著整個(gè)上皮島的更新，為主要參與腫瘤侵襲的細(xì)胞，其可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶[27]，整合細(xì)胞外基質(zhì)及降解基底膜[28]，便于上皮細(xì)胞的侵襲、遷移，增加腫瘤的破骨能力；與間質(zhì)細(xì)胞直接接觸，通過(guò)上皮-間充質(zhì)相互作用，改變腫瘤微環(huán)境[29]，增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力。P75NTR在實(shí)性型AM中外周柱狀細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度明顯高于中央星網(wǎng)狀細(xì)胞，在單囊型AM中緊鄰基底膜的柱狀細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)P75NTR強(qiáng)表達(dá), 而遠(yuǎn)離基底膜上皮細(xì)胞陰性表達(dá)，進(jìn)一步推測(cè)在AM中緊鄰基底膜的P75NTR陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞中極有可能存在腫瘤干細(xì)胞，與腫瘤的增殖相關(guān)。實(shí)性型和單囊型AM中P75NTR的表達(dá)有差異(P<0.05),而實(shí)性型的侵襲性強(qiáng)于單囊型AM[30-31]，結(jié)合P75NTR陽(yáng)性細(xì)胞在實(shí)性型AM中的分布情況，推測(cè)P75NTR表達(dá)陽(yáng)性的外周柱狀細(xì)胞中的腫瘤干細(xì)胞可能與AM侵襲相關(guān)。同時(shí)P75NTR在AM和含牙囊腫(P=0.041)及牙源性角化囊腫(P=0.03)中表達(dá)強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)P75NTR表達(dá)陽(yáng)性的外周柱狀細(xì)胞，可能參與腫瘤的侵襲性。同時(shí)，P75NTR在外周柱狀細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)，其可能為AM的潛在表面標(biāo)志物，為AM的靶向治療提供新的思路。

SOX2是胚胎和成體干細(xì)胞的一種轉(zhuǎn)錄因子，它是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，SOX2過(guò)度表達(dá)與食管癌[15]、肺癌[21]和乳腺癌[23]的發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)于維持CSCs的干性有重要作用[32]，是一種干細(xì)胞和祖細(xì)胞標(biāo)記物。其可以作為成釉細(xì)胞癌分級(jí)的一個(gè)標(biāo)志[33]，SOX2在牙齒發(fā)育中對(duì)上皮細(xì)胞的干性維持有重要作用，在多囊型AM的各種亞型上皮島中均有SOX2的表達(dá)，推測(cè)在AM中SOX2可能參與細(xì)胞干性的維持[16]。本研究中18例實(shí)性型AM有5例SOX2表達(dá)陽(yáng)性，SOX2在單囊型AM和實(shí)性型AM之間、AM與含牙囊腫之間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)SOX2在AM中可能并不參與腫瘤的侵襲性，也可能與本文選取樣本量較小、陽(yáng)性表達(dá)病例較少，無(wú)法明確探索SOX2在AM中真正意義，其是否參與干細(xì)胞特性的維持有待于進(jìn)一步研究。

在成釉細(xì)胞瘤中有干細(xì)胞標(biāo)志物P75NTR的表達(dá)，且均表達(dá)于緊鄰基底膜的柱狀上皮細(xì)胞中，考慮其與腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)。實(shí)性型AM、單囊型AM的不同表達(dá)方式，推測(cè)其可能與腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān)。在多種惡性腫瘤中，SOX2對(duì)細(xì)胞干性維持有重要作用，但在AM中表達(dá)較少，其在AM中的作用有待于進(jìn)一步探討。