莫巧明,廖煉煉,廖文彥,鄒文靜,艾文杰,梁英業(yè),田永強

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西 南寧 530201;2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023;3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530001)

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)的發(fā)生多由于軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病而直接造成[1]。它是由周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)或繼發(fā)性損害、功能障礙或短暫性紊亂(transitory perturbation)而引起的疼痛[2]。臨床中常見的NPP主要有外周性和中樞性、急性和慢性、刺激誘發(fā)性和刺激自發(fā)性等3種分類方法[3]。慢性疼痛的發(fā)病,約1/5是由于NPP引起[4],神經(jīng)損傷和炎癥刺激導(dǎo)致NPP患者受到疼痛的困擾,并存在進一步損害肢體功能的可能,對患者的身心健康和經(jīng)濟狀況造成極大的負擔(dān)。目前,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的常規(guī)療法,如口服藥物等[5],雖然能夠?qū)PP具有一定的緩解作用,但長時間使用此類藥物可產(chǎn)生多種不良反應(yīng)。基于此,尋求治療NPP的有效方法以解除患者的痛苦,減輕社會經(jīng)濟負擔(dān)成為了醫(yī)學(xué)界當(dāng)前亟待解決的問題。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中,外治療法由于其對疼痛治療的有效性,且無毒副作用的優(yōu)勢,受到了越來越多的重視[6-8]。壯醫(yī)針刺療法對于疼痛的治療效果得到了臨床的證實,但目前尚缺乏對于其作用機制的相關(guān)研究[9]。相關(guān)文獻指出[10],炎癥因子的負面刺激與NPP的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián),而細胞自噬對促炎因子具有抑制作用,相關(guān)機制已成為NPP研究的熱點。P62是細胞自噬過程中的關(guān)鍵蛋白[11]。因此,本研究以上述機制為切入點,運用壯醫(yī)針刺對NPP大鼠模型進行干預(yù),觀察驗證壯醫(yī)針刺療法對NPP的治療作用及對自噬標(biāo)志蛋白P62及炎癥因子IL-6、TNF-α表達水平的影響,從而進一步探尋壯醫(yī)針刺療法治療疼痛的內(nèi)在機制。

1 材料

1.1實驗動物 本實驗選取50只成年雄性SD大鼠進行,采購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,大鼠體質(zhì)量在250～300 g之間,生產(chǎn)許可證編號:SCXK(湘)2019-0004,使用許可證編號:SYXK(桂)2019-0001。在實驗開始前行7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)。大鼠均采取單籠喂養(yǎng),實驗室溫度控制在20～25 ℃之間,空氣濕度控制住35%～45%之間。保持環(huán)境清潔,大鼠可自由飲用自來水,以普通清潔鼠飼料飼養(yǎng)。

1.2主要試劑 RIPA細胞裂解液(C1053,北京普利萊基因技術(shù)有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)(E-BC-K318-M,Elabscience);30%丙烯酰胺(PAGE Pre-Solution,A1010,Solarbio);1 M Tris-HCL緩沖液(pH=6.8,T1020,Solarbio);1.5 M Tris-HCL緩沖液(pH=8.8,T1010,Solarbio);Marker(#26617,Thermo);PVDF膜(IPVH00010,Millipore);封閉專用脫脂奶粉(P1622,北京普利萊基因技術(shù)有限公司);牛血清白蛋白(BSA,A8020, 索萊寶);超敏發(fā)光液(RJ239676,賽默飛);內(nèi)參一抗:Mouse Anti-β-Actin(HC201,TransGen Biotech,1/2000);二抗:HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (GB23301,Servicebio,1/2000);目的一抗:Rabbit Anti p62 (af5384,Affinity,1/1000);ELISA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,PI328,PT516)。

1.3主要儀器 單道可調(diào)移液器[0.5～10 μL,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];單道可調(diào)移液器[20～200 μL,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];單道可調(diào)移液器[100～1000 μL,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];低溫高速離心機(5424R,Eppendorf);電熱恒溫水浴鍋(HH-11-2,上海助藍儀器科技有限公司);全自動酶標(biāo)儀(SuPerMax 3100,上海閃譜生物科技有限公司);紫外分光光度儀(NP80,NanoPhotometer);蛋白垂直電泳儀(DYY-6C,北京市六一儀器廠);恒溫搖床(TC-100B,上海領(lǐng)成生物科技有限公司);全自動樣品快速研磨儀(Tiss-12,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司);超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[Chemi DocTM XRS+,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司];全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon-5200,上海天能科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組及造模方法 將50只SD大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、非經(jīng)非穴組、壯醫(yī)針刺組,每組10只。參照相關(guān)文獻[12]的造模方法,通過手術(shù)結(jié)扎L5脊神經(jīng)制作神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型(SNL模型)。具體操作方法如下:配制10%水合氯醛溶液溶液,按照4 mL/kg體質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射麻醉大鼠,常規(guī)備皮消毒,在兩側(cè)髂后上嵴水平連線與脊柱交點左側(cè),沿脊柱平行方向切開約2 cm。分離皮膚、筋膜、肌肉后撐開切口露出L5椎體雙側(cè)橫突,使用咬骨鉗夾斷椎體與橫突之間的骨骼,暴露L5脊神經(jīng),以5-0規(guī)格的手術(shù)縫合線結(jié)扎,操作過程中應(yīng)注意避免牽拉脊神經(jīng)以防止造成額外損傷,雙層結(jié)扎以避免結(jié)扎線脫落。完成結(jié)扎后逐層縫合傷口。模型組、非經(jīng)非穴組、壯醫(yī)針刺組均采用上述方法造模,假手術(shù)組則只將脊神經(jīng)暴露幾分鐘,不進行結(jié)扎,余步驟同上。

1.2.2SNL模型造模成功標(biāo)準(zhǔn) 依照相關(guān)文獻[12]觀察大鼠造模后若出現(xiàn)患肢有外翻情況,且大鼠出現(xiàn)跛行、自發(fā)性抬足、趾間距變窄,行走時患肢不敢著地等情況,并檢測大鼠熱痛縮足反應(yīng)潛伏期(PWTL)是否降低,以判定SNL模型是否造模成功。

1.2.3行為學(xué)檢測 熱痛縮足反應(yīng)潛伏期(PWTL)測定[13]:在25 ℃室溫環(huán)境下,調(diào)節(jié)熱板痛覺測試儀溫度至55 ℃,放置大鼠到測試儀封閉透明玻璃盒內(nèi),啟動計時器。觀察到大鼠開始快速抬足、頻繁舔足時停止計時,記錄時間。設(shè)定該測試儀的切斷時間為30 s,以防止大鼠燙傷。連續(xù)進行3次測定,間隔時間為5 min,將3次測定時間數(shù)據(jù)的平均值作為PWTL最終的數(shù)值。

1.2.4干預(yù)措施 術(shù)后第1天開始對非經(jīng)非穴組和壯醫(yī)針刺組進行干預(yù)。壯醫(yī)針刺組:采用0.16 mm×13 mm針灸針,針刺模擬手背一環(huán)10穴(取大鼠前肢第五掌骨橈側(cè)距掌指關(guān)節(jié)3 mm處)、內(nèi)上樁、內(nèi)中樁、內(nèi)下樁、足背一環(huán)7穴(取大鼠在足背把足背橫紋中點至第二、第三足趾跖蹼緣上方紋頭之間分4等份,以足背中間點為中心,以1等份為半徑沿足背形狀作一圓環(huán)。在足背圓環(huán)上按時鐘的1～12時刻分成12等份,每時刻處為1個穴位,共12個穴位。在7時刻處為足背一環(huán)7穴),針刺深度3 mm,斜刺進針,留針30 min。連續(xù)干預(yù)10 d,至第14天結(jié)束。非經(jīng)非穴組:建模成功后每天針刺距離相應(yīng)穴位3 mm處假穴位點,留針30 min。連續(xù)干預(yù)14 d,至第14天結(jié)束。其余組別不做干預(yù),僅觀察至第14天。

1.2.5檢測標(biāo)本取材 完成干預(yù)后,在實驗第14天完成行為學(xué)檢測后,將大鼠注射水合氯醛麻醉后采集靜脈血,無痛處死后取出L4-6脊髓背角組織,放入液氮冷卻,放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.6Western Blot檢測 運用Western Blot(免疫印跡法)檢測大鼠脊髓背角蛋白表達水平。取出大鼠脊髓組織后,以裂解液裂解細胞,研磨勻漿放入離心機提取總蛋白。轉(zhuǎn)膜后以免疫反應(yīng)發(fā)光處理,放入凝膠成像儀進行分析,分別測出P62蛋白及內(nèi)參蛋白條帶灰度值,得到P62蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值即為P62的相對表達水平。

1.2.7ELISA 檢測 抽取大鼠靜脈血后放入試管,將試管放入離心機離心提取血清,按照ELISA檢測試劑盒步驟說明檢測大鼠血清中IL-6、TNF-α的含量水平。

2 結(jié)果

2.1PWTL檢測結(jié)果 造模前各組大鼠PWTL檢測數(shù)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義;術(shù)后第1天模型組、非經(jīng)非穴組、壯醫(yī)針刺組PWTL檢測數(shù)值明顯低于正常組、假手術(shù)組(P<0.01),模型組、非經(jīng)非穴組、壯醫(yī)針刺組之間PWTL檢測數(shù)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義;術(shù)后第14天壯醫(yī)針刺組PWTL檢測數(shù)值高于模型組和非經(jīng)非穴組(P<0.01)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠PWTL比較 單位:s

圖1 各組大鼠術(shù)前(0 d)、術(shù)后第1天、第14天PWTL比較

2.2大鼠脊髓背角P62含量的變化 術(shù)后第14天,與正常組、假手術(shù)組比較,模型組大鼠脊髓背角P62蛋白表達水平升高(P<0.01),與模型組、非經(jīng)非穴組比較,壯醫(yī)針刺組大鼠脊髓背角P62蛋白表達水平下調(diào)(P<0.05)。見圖2。

注:與正常組、假手術(shù)組比較,*P<0.01;與模型組、非經(jīng)非穴組比較,#P<0.05。

2.3大鼠血清IL-6、TNF-α含量的變化 造模后第14天,正常組大鼠血清IL-6、TNF-α含量處于低水平,與正常組、假手術(shù)組相比較,模型組血清IL-6、TNF-α含量升高(P<0.01),與模型組、非經(jīng)非穴組相比較,壯醫(yī)針刺組可下調(diào)大鼠血清IL-6、TNF-α含量(P<0.05)。見圖3、圖4。

注:與正常組、假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組、非經(jīng)非穴組比較,#P<0.05。

圖4 各組大鼠血清TNF-α含量變化

3 討論

壯醫(yī)認為“疾患并非無中生,乃系氣血不均衡”,指出了疼痛治療的關(guān)鍵在于“通”,“通則不痛”,及時調(diào)暢龍路和火路,使局部得到氣血滋養(yǎng)是治療疼痛的指導(dǎo)思想[14]。“三道兩路”是壯醫(yī)學(xué)理論中所描述的人體基本生理系統(tǒng),其中兩路之中的龍路為人體血液循環(huán)系統(tǒng),火路的作用則與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中人體神經(jīng)系統(tǒng)相類似[15]。兩路與疼痛密切相關(guān),兩路不通或不榮皆可造成疼痛,具體包含虛實兩個方面的病機,涵蓋了氣血循環(huán)不暢、神經(jīng)通路受阻、病理性因子壅塞、氣虛流動及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)節(jié)因子異常等情況。疼痛發(fā)生時,人體常出現(xiàn)“不通”的病理狀態(tài),而氣血運行受阻又會導(dǎo)致病變部位出現(xiàn)“不榮”。氣與血相互配合,運行流暢是維持人體正常生理狀態(tài)的重要基礎(chǔ)。當(dāng)毒邪外侵機體,阻滯兩路,使機體氣血運行不暢,氣血失衡,瘀血阻滯龍路、火路,或毒邪未盡,毒瘀互結(jié),阻滯龍路、火路,致使兩路道路不通,而發(fā)為NPP。NPP屬龍路病、火路病范疇。大多數(shù)患者常常出現(xiàn)明顯的持續(xù)性燒灼痛、閃電樣或撕裂樣疼痛,發(fā)作時患者常覺寢食不安,龍、火二路發(fā)生疼痛時持續(xù)數(shù)日或數(shù)月不等,部分可纏綿數(shù)年[16]。該病對患者的身心健康和生活質(zhì)量具有嚴重的負面影響。

本研究通過運用壯醫(yī)針刺療法刺激手背一環(huán)10穴、內(nèi)上樁、內(nèi)中樁、內(nèi)下樁、足背環(huán)一7穴對疼痛模型大鼠進行干預(yù)[17]。壯醫(yī)針刺療法在臨床上大量運用環(huán)穴,其理論來源[17]為壯醫(yī)針刺選穴的重要理論依據(jù)和指導(dǎo)原則“天圓地方”。以方圓對應(yīng)天地,運用取象比類的思維,將“動”與“衡”的特點體現(xiàn)在配穴處方中,通過動態(tài)調(diào)整氣血以恢復(fù)人體的平衡。手背一環(huán)10穴,為天部穴位,在壯醫(yī)看來,手部在人體各部位中運動頻率最高,聯(lián)系現(xiàn)代解剖學(xué)知識,手部所對應(yīng)的大腦皮層面積最大,手部神經(jīng)末梢對針刺刺激的敏感程度也非常高,故通過刺激手背環(huán)穴可迅速將刺激信號傳入“巧塢”(大腦),從而形成良性反饋,通利三道兩路以緩解疼痛。與手背環(huán)穴為天部在上相對應(yīng),內(nèi)上樁、內(nèi)中樁、內(nèi)下樁三穴為地部穴,又稱為“地內(nèi)三樁”,天地相對共同調(diào)節(jié)整體氣血的流動。足背一環(huán)7穴為位于足背部,屬于足背環(huán)穴之一,臨床上可治療腰腿疼痛等位于人體下部的疼痛,且足背部神經(jīng)末梢亦較為敏感。故本研究所取穴位能夠通過整體調(diào)節(jié)氣血達到治療疼痛的效果。

炎癥是人體常見的一種病理狀態(tài),在多種疾病中均可出現(xiàn)。炎癥對人體的損害是多方面的,可影響多個系統(tǒng)的生理功能,其負面刺激性作用是導(dǎo)致疼痛發(fā)生的重要因素,是NPP發(fā)生發(fā)展的重要機制[18]。炎癥因子對神經(jīng)系統(tǒng)除具有免疫相關(guān)作用外,其對神經(jīng)細胞的刺激是造成疼痛的重要原因[19]。炎癥表達和神經(jīng)損傷是NPP的主要病理基礎(chǔ),神經(jīng)損傷狀態(tài)下,IL-6、TNF-α等炎癥因子從脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)中誘導(dǎo)釋放,引起炎癥發(fā)生,并通過級聯(lián)放大作用降低神經(jīng)元興奮閾值,使外周和中樞的神經(jīng)感受器致敏,提高痛覺敏感性[20]。細胞自噬是一種細胞自我保護性機制,在NPP發(fā)生發(fā)展過程中,自噬機制也參與到其中[21]。其對于相關(guān)促炎性因子具有清除作用[21],通過自噬小體的吞噬作用,可清除對神經(jīng)細胞具有負面刺激作用的促炎分子,解除負面刺激作用,從而抑制炎癥表達并緩解由此帶來的疼痛[22],對細胞也具有保護作用[23]。相關(guān)研究表明,NPP發(fā)生時常出現(xiàn)自噬調(diào)節(jié)失衡。在病理性因素的刺激下,人體啟動細胞自噬,清除受損細胞器,識別炎癥信號,清除有害炎癥因子以調(diào)控炎癥表達水平,抑制炎癥刺激以緩解疼痛。相關(guān)實驗研究也證實了自噬抑制了SNL大鼠脊髓背角神經(jīng)元的凋亡[24]。自噬機制調(diào)節(jié)炎癥表達對緩解疼痛起到重要的調(diào)節(jié)作用,對IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達具有抑制作用[25]。

P62是一種重要的自噬標(biāo)志性蛋白,是自噬機制中的特異性底物。在自噬過程中,P62首先結(jié)合細胞內(nèi)泛素化蛋白質(zhì),然后結(jié)合LC3Ⅱ蛋白,成為自噬關(guān)節(jié)復(fù)合物,自噬機制活躍則細胞內(nèi)P62蛋白會減少。反之,若自噬機制受到抑制,則P62蛋白在細胞內(nèi)會增多。P62的表達水平可反映細胞自噬機制的活躍程度,在本研究中,造模后第1天,模型組大鼠熱痛縮足反應(yīng)潛伏期(PWTL)較正常組降低,造模后第14天,壯醫(yī)針刺組大鼠熱痛縮足反應(yīng)潛伏期(PWTL)較模型組升高,表明實驗造模成功,壯醫(yī)針刺對SNL模型大鼠的疼痛具有改善作用。造模后第14天,模型組大鼠血清IL-6、TNF-α含量較正常組升高,壯醫(yī)針刺組血清IL-6、TNF-α較模型組降低,表明造模導(dǎo)致大鼠神經(jīng)損傷,炎癥因子釋放增減,激活炎癥反應(yīng)導(dǎo)致疼痛,經(jīng)壯醫(yī)針刺干預(yù)后炎癥因子含量減少,減輕了神經(jīng)所受到的炎癥刺激,使疼痛得以緩解。造模后第14天,模型組大鼠脊髓背角組織P62蛋白表達較正常組增多,壯醫(yī)針刺組大鼠脊髓背角P62蛋白表達較模型組減少,表明SNL模型大鼠細胞內(nèi)自噬機制被抑制,而壯醫(yī)針刺干預(yù)可增加細胞內(nèi)自噬活躍水平,壯醫(yī)針刺可能通過調(diào)節(jié)細胞自噬以達到緩解疼痛的效果。

綜上可以推斷,經(jīng)壯醫(yī)針刺干預(yù)后SNL大鼠脊髓背角組織P62蛋白表達水平升高,反映出細胞自噬機制被激活,從而減少了炎癥因子IL-6、TNF-α的表達,減輕了神經(jīng)炎癥反應(yīng),達到鎮(zhèn)痛的效果。