鄧櫻花，曾國(guó)平，張洪權(quán)

(1.湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430205；2.植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430205)

葡萄糖腦苷脂酶(GBA)基因突變可導(dǎo)致戈謝病(GD)[1-3]。GD患者和GBA基因突變攜帶者罹患路易體、帕金森氏病(PD)或帕金森氏癡呆癥的風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。由于GBA基因編碼的蛋白β-葡萄糖腦苷脂酶(GCase)是一種重要的溶酶體水解酶，它可將葡萄糖腦苷脂分解為葡萄糖神經(jīng)酰胺(GluCer)和葡萄糖鞘氨醇(GluSph)[3]。已有研究表明，GBA基因的突變可能導(dǎo)致神經(jīng)元中有毒物質(zhì)例如蛋白α-synuclein的聚集，進(jìn)而損壞溶酶體并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。半乳糖神經(jīng)酰胺酶(GALC)基因突變會(huì)導(dǎo)致克拉伯病(KD)[5]。與GCase一樣，GALC也存在于細(xì)胞溶酶體中，并降解特定的半乳糖鞘脂，包括半乳糖神經(jīng)酰胺(GalCer)和半乳糖鞘氨醇(GalSph)[6]。這些鞘糖脂分子是髓磷脂的重要成分，它們是某些神經(jīng)細(xì)胞周?chē)谋Ｗo(hù)層，可確保神經(jīng)脈沖的快速傳遞。鞘糖脂分子在髓磷脂的產(chǎn)生過(guò)程中形成，在正常的生理?xiàng)l件下會(huì)被GCase和GALC迅速分解至非常低的水平。GCase和GALC的功能喪失導(dǎo)致鞘糖脂分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中積累，引起退行性神經(jīng)病變。研究這些底物可以將蛋白或者基因的功能喪失與疾病的發(fā)生和發(fā)展聯(lián)系起來(lái)，在神經(jīng)變性疾病領(lǐng)域已引起了越來(lái)越多的關(guān)注[7,8]。

從化學(xué)結(jié)構(gòu)上講，鞘糖脂分子可細(xì)分為4個(gè)亞類(lèi)：GluCer、GalCer、GluSph和GalSph。GluSph和GalSph均只含有單不飽和鍵碳十八一種脂肪鏈，是一對(duì)立體異構(gòu)體，區(qū)別僅在于糖上一個(gè)羥基的軸向或赤道構(gòu)型。但是GluCer和GalCer分別是一系列化合物，每個(gè)子類(lèi)含有一系列不同碳鏈、飽和度多樣及豐度不一的脂肪酸，極大地增加了糖鞘脂在生物體系中的復(fù)雜性。從樣品制備到分離和定量檢測(cè)這些糖鞘脂一直是分析研究者的難題。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)由于其優(yōu)異的靈敏度和高通量，成為分析脂質(zhì)體，包括糖鞘脂分子的一種首選手段[9-14]。最近一項(xiàng)研究利用超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)來(lái)探索GCase缺乏是否與其在PD腦組織中的GluCer底物的積累有關(guān)。通過(guò)分析26名PD患者的顳皮質(zhì)大腦組織中的GluCer亞型水平，成功將這些患者分為三個(gè)PD疾病階段，建立疾病發(fā)展評(píng)價(jià)系統(tǒng)[11]。雖然鞘糖脂類(lèi)分析存在一系列困難，但是隨著液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的靈敏度不斷提高，這些鞘糖脂化合物的分析越來(lái)越令人滿(mǎn)意[15]。

在本文中，我們建立一種基于親和色譜柱的高通量方法，改進(jìn)了文獻(xiàn)報(bào)道的方法，并設(shè)計(jì)新穎的梯度重新活化色譜柱，可將LC-MS/MS靈敏度提高一個(gè)數(shù)量級(jí)，滿(mǎn)足腦脊髓液(CSF)中極低濃度的檢測(cè)。并在10 min內(nèi)同時(shí)分離GluCer/GalCer和GluSph/GalSph兩組異構(gòu)體分子。我們的方法成功應(yīng)用于分析幾種疾病模型小鼠生物樣品包括血液、細(xì)胞、CSF及腦組織，準(zhǔn)確定量了鞘糖脂分子的變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

高效液相色譜儀(Agilent1290，美國(guó))；質(zhì)譜儀(三級(jí)四極桿Triple Quad 5500+ System，Sciex，美國(guó))；手持式高速勻漿機(jī)F6/10(凈信，上海)；超純水儀(Millipore Integral.5，Merck Millipore)；離心機(jī)(5810R，Eppendorf)。LoBind低蛋白吸附管1.5mL(艾本德(中國(guó))有限公司)。親水親脂天平固相萃取柱(Oasis HLB 1 cc,10 mg填料,30 μm，PN 186000383，Waters，英國(guó))。

內(nèi)標(biāo)：C18 Glucosyl(β) Ceramide-d5(Avanti Lipid,PN 860673)，Glucosyl(β) Sphingosine-d7 (Avanti Lipid,PN 860695)。乙腈、甲醇和異丙醇均為色譜/質(zhì)譜級(jí)，購(gòu)于Tedia(美國(guó)Tedia Chemical)。乙酸銨、甲酸和甲酸銨購(gòu)于Sigma-Aldrich Corp(上海)。實(shí)驗(yàn)用水來(lái)自18.2 MΩ·cm反滲透超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

HALO親和色譜柱：150 mm×3.0 mm，2.0 μm，色譜柱(PN 91813-701，Advanced Materials Technology,Inc.，威明頓，美國(guó))。液相色譜流動(dòng)相A為：水/甲醇/乙腈(92.5/5/2.5，%)(0.5%甲酸和5 mmol/L甲酸銨)；B為：乙腈/甲醇/水(92.5/5/2.5%)(0.5%甲酸和5 mmol/L甲酸銨)。梯度程序如下：0.0～2.5 min，100%B；2.5～5 min從100%B降至85%B，保持85%B時(shí)至6.5 min；在6.6 min時(shí)降為5%B，并保持至7.5 min；在8 min時(shí)恢復(fù)到100%，并保持至10min。

三級(jí)四極桿質(zhì)譜采用電噴霧電離正離子模式，Turbo V離子源設(shè)置：30的簾氣(CUR)；碰撞氣體設(shè)定為中等；5.2 kV的離子噴霧電壓；溫度在400 ℃;離子源氣體1(霧化氣)45 psi;離子源氣體2(加熱氣)50 psi;去簇電壓(DP)70 V；進(jìn)入電位10 V；碰撞池的出口電位為12.5 V。以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，GluCer和GalCer組分的碰撞能量(CE=32)，GluSph/GalSph碰撞能量(CE=12)，質(zhì)譜檢測(cè)不同分子離子對(duì)如下：GluCer/GalCer：C16∶0(700.6/264.3);C18∶0(728.6/264.3);C20∶0(756.6/264.3);C22∶0(784.7/264.3);C24∶1(810.7/264.3);C24∶0(812.7/264.3)；GluSph/GalSph(464.2/264.3);內(nèi)標(biāo)離子對(duì)GluCer(d18∶1/18∶0)-d5(733.6/269.3);GluSph-d7(471.2/269.3)。使用MultiQuant 3.02(Sciex)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量，最后將待測(cè)物通過(guò)內(nèi)標(biāo)歸一化，再根據(jù)樣品體積或重量計(jì)算生物樣品中鞘糖脂分子的含量。

1.3 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液配制

將購(gòu)買(mǎi)的C18 GluCer-d5(1 mg)和GluSph-d7(1 mg)分別溶于1 mL甲醇。取適當(dāng)體積稀釋并混合在一起，混合后濃度均為2 ng/μL。甲醇萃取溶液(含內(nèi)標(biāo))配制是將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液與甲醇按2∶100稀釋。計(jì)算甲醇萃取液需求量按如下計(jì)算：每個(gè)CSF樣本(5 μL)或者細(xì)胞樣本需要95 μL甲醇萃取液(其中含2 μL 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液)、以每個(gè)血液(10 μL)樣本需要190 μL甲醇萃取液(其中含4 μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液)、每個(gè)腦組織樣本需要395 μL甲醇萃取液(其中含4 μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液)。配制萃取液時(shí)，要多配制10%體積，以考慮可能存在的瓶壁吸附和揮發(fā)損失。

1.4 樣品處理

1.4.1 CSF收集將CSF樣品收集在蛋白低吸附試管中，在4 ℃下離心(2 000×g)10 min，去除細(xì)胞和碎片，快速冷凍并將樣品保存在-80 ℃直至分析。在CSF提取之前，對(duì)樣品進(jìn)行隨機(jī)分組。在冰上解凍樣品，在4 ℃以21 000×g離心10 min，并棄去含有紅色沉淀的CSF樣品。

1.4.2 CSF和細(xì)胞樣品萃取配制好需要的甲醇萃取液(含2%體積內(nèi)標(biāo))，放置于冰上。使用精準(zhǔn)移液器轉(zhuǎn)移5 μL CSF到低吸附試管。移萃取液前，用冰甲醇預(yù)潤(rùn)濕吸頭，以避免滴落。然后向CSF樣品添加95 μL 含有2 ng的內(nèi)標(biāo)物甲醇溶液，封蓋瓶口，在室溫下?lián)u動(dòng)5 min。在-20 ℃靜置1 h，使蛋白質(zhì)進(jìn)一步沉淀。在4 ℃以4 000×g離心20 min；取出全部上清液，將其在氮?dú)饬飨率覝卮蹈? h。樣品在-80 ℃冰箱保存直至分析。分析前將其用50 μL的流動(dòng)相B溶解、離心，然后進(jìn)樣LC-MS分析。細(xì)胞的萃取流程一樣，只是樣品換成經(jīng)過(guò)記數(shù)的細(xì)胞。

1.4.3 血液樣品萃取在冰上解凍收集的血液樣品，在4 ℃以21 000×g離心10 min，并棄去含有紅色沉淀的血液樣品。配制好需要的甲醇萃取液，放置于冰上。轉(zhuǎn)移10 μL樣品至低吸附試管，然后向樣品中添加190 μL含有4 ng內(nèi)標(biāo)物的甲醇溶液。在室溫下?lián)u晃5 min，在-20 ℃放置1 h，在4 ℃以4 000×g離心20 min；取100 μL上清液，將其在室溫用氮?dú)獯蹈? h。后溶解于50 μL的流動(dòng)相B，離心，然后進(jìn)樣LC-MS分析。

1.4.4 從腦組織中提取脂質(zhì)提取參照文獻(xiàn)方法[11]并進(jìn)行一定的改進(jìn)。首先將腦組織隨機(jī)分組并編號(hào)，保持冷凍條件下迅速切割并稱(chēng)量20±2 mg組織，將樣品轉(zhuǎn)移到2 mL Eppendorf管中，在冷室中將組織勻漿30 s。依次加入400 μL甲醇(含8 ng標(biāo)準(zhǔn)品)、30 μL DMSO和300 μL丙酮至腦組織勻漿樣品中，將混合物渦旋振蕩30 min，最后加入150 μL水到管中，再渦旋30 s并以10 000×g離心1 min，回收上清液。上清液用150 μL水稀釋并上載到親水親脂天平固相萃取柱(用1 mL甲醇預(yù)處理)。用1 mL 60%甲醇/30%H2O/10%丙酮淋洗，樣品用1 mL 90%丙酮/10%甲醇洗脫。最后取250 μL樣品在氮?dú)獗Ｗo(hù)下吹干，并重新溶解于100 μL流動(dòng)相B相進(jìn)行LC-MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 建立新穎的液相色譜流動(dòng)相梯度

本文建立了一個(gè)完全新穎的色譜流動(dòng)相梯度，如圖1A所示。本梯度開(kāi)始于100%B，等梯度運(yùn)行2～3 min，此正相色譜方法可基線(xiàn)分離GluCer和GalCer[11,13]。隨后保持85%～95%高比例有機(jī)相至6～7 min，再升至95%～100%A高比例水相，此時(shí)GluSph和GalSph被分離。文獻(xiàn)報(bào)道曾使用兩根尺寸不一樣的色譜柱[13]，并采用兩個(gè)獨(dú)立的等度方法分別分離GluCer/GalCer異構(gòu)體和GluSph和GalSph異構(gòu)體。其缺點(diǎn)在于兩個(gè)方法切換需要更換流動(dòng)相和色譜柱，降低了工作效率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)親和色譜柱在等度運(yùn)行35個(gè)樣品之后，靈敏度顯著降低約90%(圖1D和1E)。采用新建立的梯度方法，色譜柱在運(yùn)行20次后被重新活化，所測(cè)試內(nèi)標(biāo)物的峰高回到接近于色譜柱效率下降之前(圖1D和1E)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高水相的開(kāi)始時(shí)間，對(duì)GluSph和GalSph能否達(dá)到基線(xiàn)分離影響很大；另外，水相的比例對(duì)于能否重新活化色譜柱影響很大，通過(guò)反復(fù)測(cè)試在6～7 min水相的不同比例，最后確定95%～100%A的效果最佳。圖1B顯示正常小鼠CSF中豐度最高的6種GluCer和GalCer，依次是C24∶1、C22∶0、C24∶0、C18∶0、C20∶0和C16∶0。其中GalCer濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GluCer，這與它們?cè)谀X中的含量分布類(lèi)似。本梯度方法成功用于檢測(cè)小鼠CSF中的GluSph和GalSph。如圖1C所示，CSF中的GluSph含量比GalSph高，這一點(diǎn)與腦中含量相反。

圖1 (A)LC梯度；(B)小鼠CSF的6種GluCer和GalCer；(C)小鼠CSF的GluSph和GalSph；(D)等度運(yùn)行，色譜柱靈敏度在分析35個(gè)樣品后降至10%左右(采用本實(shí)驗(yàn)的梯度，柱效在20多個(gè)樣品后基本完全恢復(fù))；(E)內(nèi)標(biāo)物L(fēng)C峰強(qiáng)度對(duì)比Fig.1 (A) LC gradient；(B) 6 species of GluCer and GalCer in mouse CSF；(C) GluSph and GalSph in mouse CSF；(D) the isocratic LC shows a degradation of sensitivity by 90% after 35 runs(red) and the column was recovered by our gradient after 25 runs；(E) the peak of internal standard GluCer(18∶1/18∶0)-d5

2.2 疾病模型小鼠與野生小鼠中GluSph和GalSph含量對(duì)比

我們研究了幾種疾病小鼠模型及野生型小鼠的生物樣品，其中包括β-葡糖苷酶抑制劑(CBE)注射的小鼠腦組織，GBA敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和自然突變的twitcher小鼠的血漿，CBE小鼠和GBA敲除模型用于研究戈謝病(GD)或者帕金森。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在注射10周CBE雄性小鼠的腦中GluSph含量比野生型小鼠腦中上升超過(guò)百倍，而GalSph幾乎沒(méi)有變化(圖2a和2g)。在GBA敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，GluSph和GalSph沒(méi)有明顯變化(圖2d和2e)。證實(shí)了β-葡糖苷酶GCase的缺失，極大的影響CNS。但在基因敲除的動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)，GCase的抑制尚未達(dá)到明顯效果。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)12周的twitcher小鼠的血漿中，相對(duì)于野生型GalSph增加了近百倍，而GluSph完全沒(méi)有受到影響(圖2b和2c)。充分說(shuō)明twitcher小鼠模型中GALC的突變，以及這個(gè)模型用于研究克拉伯病的有效性，同時(shí)說(shuō)明這些酯類(lèi)作為疾病通路標(biāo)志物的可能性[16,17]。

圖2 代表性色譜圖。GluSph和GalSph在三種疾病模型小鼠和野生型小鼠的腦、細(xì)胞及血漿中的變化。(a)野生型小鼠腦；(g)CBE小鼠腦；(d)野生型小鼠細(xì)胞；(e)GBA敲除小鼠細(xì)胞；(b)野生型小鼠血漿；(c)twitcher小鼠血漿；(f)內(nèi)標(biāo)Fig.2 Representative chromatograms of GluSph and GalSph in three mouse models and wide type mouse.(a) the brain of WT;(g) the brain of CBE;(d) the cell of WT;(e) the cell of GD KO;(b) the plasma of WT;(c) the plasma of twitcher mouse；(f) internal standard

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和靈敏度

圖3顯示GluCer(d18∶1/18∶0)相對(duì)于2 000 pg內(nèi)標(biāo)(即加入每個(gè)樣品的內(nèi)標(biāo)總量，見(jiàn)1.4節(jié))，GluCer(d18∶1/18∶0)-d5從3.8 pg到15 625 pg的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(進(jìn)樣體積5 μL)。結(jié)果表明新建立方法的線(xiàn)性范圍很寬，達(dá)到4個(gè)數(shù)量級(jí)，相關(guān)系數(shù)R2>0.995，定量限達(dá)10 pg，檢出限低至3 pg。濃度分別為12 000、1 200及50 pg的高、中、低質(zhì)控樣品，測(cè)量準(zhǔn)確率不低于85%。脂類(lèi)的質(zhì)譜分析中，基于同一類(lèi)脂離子化效率大致相同，往往使用單一內(nèi)標(biāo)來(lái)定量不同長(zhǎng)度脂肪酸鏈的分子以減少摻入內(nèi)標(biāo)的可能干擾。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)葡萄糖和半乳糖神經(jīng)酰胺離子化效率也近似相同，故而這個(gè)曲線(xiàn)被用于本文中所有的GluCer和GalCer分子定量。文獻(xiàn)報(bào)道GD模型CSF的含量為280 pmol/mL[18]，故5 μL小鼠CSF中GluCer含量約為980 pg。CSF萃取過(guò)程是將5 μL 樣品稀釋到50 μL，再進(jìn)樣5 μL，所以進(jìn)樣量為CSF的1/10。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)樣的GluCer含量約為110 pg，CSF中含量約為1 100 pg，此濃度略高于報(bào)道的濃度，遠(yuǎn)高于我們的定量限(10 pg)。說(shuō)明了我們新建立的方法的靈敏度很高，而且適用性強(qiáng)，適用于檢測(cè)低至5 μL的CSF或者20 mg組織中GluCer及GalCer含量。

圖3 GluCer(d18∶1/18∶0)相對(duì)于內(nèi)標(biāo)GluCer(d18∶1/18∶0)-d5的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.3 Standard curve of GluCer(d18∶1/18∶0) peak area ratio to GluCer(d18∶1/18∶0)-d5

2.4 方法的應(yīng)用

將本文建立的方法應(yīng)用于CBE小鼠和野生型(WT)小鼠腦樣品，以及twitcher小鼠和WT小鼠血漿樣品中四類(lèi)鞘糖脂分子的檢測(cè)。從圖4A～D可以看出CBE小鼠腦中GluSph的含量明顯升高，比WT腦中高127倍，這與文獻(xiàn)報(bào)道GluSph是GD關(guān)鍵生物標(biāo)志物一致[8]。GluCer和GalSph變化程度類(lèi)似，約增高7倍。圖4E～H反映了twitcher小鼠血漿中四類(lèi)鞘糖脂分子的含量及其相對(duì)于WT小鼠的變化，可以看出GalSph是最明顯的標(biāo)志物，其含量增高達(dá)到155倍，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]；GluCer和GluSph則沒(méi)有明顯變化。這與圖2b和2c的色譜圖對(duì)比結(jié)果一致。

圖4 CBE小鼠腦組織中GluCer(A)、GalCer(B)、GluSph(C)、GalSph(D)和Twitcher；小鼠的血漿中GluCer(E)、GalCer(F)、GluSph(G)和GalSph(H)相對(duì)于野生型小鼠的變化Fig.4 The level of GluCer(A),GalCer(B),GluSph(C),GalSph(D) in the brain of CBE mouse verse of WT mouse；The level of GluCer(E),GalCer(F),GluSph(G) and GalSph(H) in the plasma of Twitcher mouse verse of WT mouse

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)了非常新穎的親和色譜梯度洗脫方法，建立了同時(shí)測(cè)定疾病模型小鼠和野生型小鼠的腦、血漿、細(xì)胞和腦脊液中4種鞘糖脂分子的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，研究了鞘糖脂分子在幾種神經(jīng)退行性疾病模型中作為生物標(biāo)志物的有效性。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好、線(xiàn)性范圍寬，為神經(jīng)科學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)研究提供強(qiáng)有力的工具。