龔珂珂，李豐哲，王 紅，王富安

(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

1 引言

癌癥是一種危害人類健康的重要疾病。雖然相關(guān)診療方法已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是癌癥仍然是導(dǎo)致我國(guó)人口死亡的主要原因之一。MicroRNA(miRNA)長(zhǎng)約18～25個(gè)堿基，具有高度保守性，是一類在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA[1]。miRNA在多種生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及凋亡等。最近，越來(lái)越多的臨床數(shù)據(jù)表明，miRNA表達(dá)水平的失調(diào)與人類某些疾病(如癌癥)密切相關(guān)，因而它們可用作潛在的癌癥標(biāo)志物[2]。miRNA的高靈敏度和高特異性檢測(cè)，不僅在生物學(xué)研究領(lǐng)域引起廣泛的關(guān)注，而且在多種疾病的分類、診斷以及預(yù)后方面也具有重要研究?jī)r(jià)值[3-5]。由于miRNA具有序列短、同源性高以及豐度低等特性，對(duì)其檢測(cè)存在一定的難度[6]。

傳統(tǒng)的miRNA檢測(cè)方法主要有逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)[3,7]、Northern印記[8,9]、微陣列技術(shù)[10,11]等。然而這些方法存在操作繁瑣、檢測(cè)靈敏度低等缺點(diǎn)。核酸擴(kuò)增作為一種現(xiàn)代miRNA檢測(cè)方法，尤其是恒溫核酸擴(kuò)增，因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和且擴(kuò)增效率高，所以備受研究者們的關(guān)注。目前已經(jīng)發(fā)展了許多基于恒溫核酸擴(kuò)增的miRNA分析方法，這些方法根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中是否有蛋白酶參與，可以分為酶介導(dǎo)的恒溫核酸擴(kuò)增和恒溫?zé)o酶核酸擴(kuò)增。由于恒溫?zé)o酶核酸擴(kuò)增無(wú)需價(jià)格昂貴且穩(wěn)定性差的蛋白酶參與，在miRNA分析方面具有良好的應(yīng)用前景。本文簡(jiǎn)要介紹了一些用于miRNA檢測(cè)的恒溫?zé)o酶核酸擴(kuò)增方法，為研究者們探索高靈敏度和高特異性的miRNA分析方法提供參考。

2 恒溫?zé)o酶核酸擴(kuò)增方法用于miRNA檢測(cè)

2.1 基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)檢測(cè)miRNA

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)概念是由Dirks和Pierce在2004年提出的[12]。如圖1A，經(jīng)典的HCR體系包含有兩個(gè)處于亞穩(wěn)定狀態(tài)的發(fā)夾反應(yīng)物(H1和H2)。靶標(biāo)Ⅰ不存在時(shí)，H1和H2穩(wěn)定地共存于溶液中(過(guò)程a)；引入靶標(biāo)Ⅰ時(shí)，靶標(biāo)Ⅰ通過(guò)toehold打開發(fā)夾H1，生成Ⅰ-H1中間體(過(guò)程b)；Ⅰ-H1中間體暴露出的toehold進(jìn)一步打開發(fā)夾H2，生成Ⅰ-H1·H2(過(guò)程c)，同時(shí)發(fā)夾H2又暴露出與靶標(biāo)Ⅰ相同的序列，打開新的發(fā)夾H1。如此，靶標(biāo)Ⅰ能夠在發(fā)夾H1和H2之間引發(fā)一系列雜交反應(yīng)，形成長(zhǎng)的雙鏈共聚物。近幾年，研究人員基于HCR反應(yīng)提出了各種各樣的miRNA檢測(cè)方法，其中一些方法甚至能夠用于活細(xì)胞中miRNA成像。例如，Li實(shí)驗(yàn)室基于HCR反應(yīng)和氧化石墨烯(GO)，構(gòu)建了一個(gè)熒光傳感器用于miRNA檢測(cè)，靶標(biāo)let-7a通過(guò)toehold打開GO表面吸附的熒光發(fā)夾H*1，生成新的toehold，進(jìn)一步打開發(fā)夾H*2，并暴露出與靶標(biāo)相同的序列引發(fā)新的發(fā)夾H*1打開。如此，發(fā)夾H*1和H*2之間發(fā)生一系列雜交事件，生成大量的高分子聚合物，使得發(fā)夾末端修飾的熒光團(tuán)遠(yuǎn)離GO，熒光信號(hào)增強(qiáng)，該方法為原位熒光成像miRNA及其他生物標(biāo)志物提供了新途徑[13]。隨后，Tang課題組基于HCR和GO發(fā)展了一種雙靶標(biāo)識(shí)別的miRNA檢測(cè)方法，靶標(biāo)miR-21在發(fā)夾H1和H2之間引發(fā)HCR反應(yīng)，產(chǎn)生綠色熒光信號(hào)，靶標(biāo)let-7a在發(fā)夾H3和H4之間引發(fā)HCR反應(yīng)，產(chǎn)生紅色熒光信號(hào)，為同時(shí)成像多種低表達(dá)生物標(biāo)志物提供了新方法，提高了癌癥早期診斷的準(zhǔn)確性(圖1B)[14]。雖然這些基于GO的miRNA成像方法促進(jìn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)miRNA穩(wěn)態(tài)異常的監(jiān)測(cè)，但是GO納米材料存在潛在的細(xì)胞毒性等問(wèn)題。為了解決這一問(wèn)題，Yuan實(shí)驗(yàn)室[15]和Wang實(shí)驗(yàn)室[16]基于可降解的MnO2納米片和HCR反應(yīng)，分別發(fā)展了新的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)擴(kuò)增方法用于細(xì)胞內(nèi)miRNA 成像，通過(guò)GSH降解MnO2，釋放出熒光團(tuán)修飾的發(fā)夾探針，隨后細(xì)胞內(nèi)miRNA引發(fā)發(fā)夾探針發(fā)生HCR反應(yīng)，自組裝形成雙鏈DNA聚合物，使得熒光信號(hào)增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中痕量miRNA的檢測(cè)。

為提高單級(jí)HCR反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度，Wei等構(gòu)建了一個(gè)級(jí)聯(lián)HCR反應(yīng)體系用于細(xì)胞內(nèi)miRNA的檢測(cè)以及成像[17]。如圖1C所示，靶標(biāo)Ⅰ引發(fā)上游HCR-1發(fā)夾反應(yīng)物H1和H2發(fā)生HCR反應(yīng)，生成Ⅰ-H1·H2中間體，同時(shí)暴露出目標(biāo)序列T，激活下游HCR-2反應(yīng)，最終得到大量雙鏈DNA聚合物T-(H3·H4·H5·H6)n，使得熒光團(tuán)和猝滅劑相互靠近，熒光信號(hào)降低，實(shí)現(xiàn)了3 pmol/L的檢測(cè)靈敏度。雖然目前已經(jīng)報(bào)道了許多基于HCR的恒溫?cái)U(kuò)增方法用于miRNA檢測(cè)以及細(xì)胞內(nèi)成像，但是HCR擴(kuò)增方法在生物傳感以及生物成像方面仍面臨挑戰(zhàn)，例如單靶標(biāo)激活發(fā)夾探針引發(fā)的假陽(yáng)性信號(hào)。因此，構(gòu)建基于HCR的高特異性miRNA檢測(cè)新方法非常重要。

圖1 (A)HCR反應(yīng)原理[12]；(B)基于HCR和GO對(duì)細(xì)胞內(nèi)的miRNA進(jìn)行成像[14]；(C)串聯(lián)HCR反應(yīng)用于miRNA檢測(cè)及成像[17]Fig.1 (A) The principle of HCR[12];(B) Intracellular miRNA imaging based on HCR and GO[14];(C) The concatenated HCR circuit for miRNA detection and imaging [17]

2.2 基于催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)(CHA)檢測(cè)miRNA

催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)的基本概念是由Pierce等于2008年提出的[18]。如圖2A所示[19]，該反應(yīng)是一種自由能驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)，目標(biāo)物C1通過(guò)toehold打開發(fā)夾探針H1，生成C1-H1中間體，H1上暴露出的toehold進(jìn)一步打開發(fā)夾H2，生成雙鏈產(chǎn)物H1-H2，同時(shí)，目標(biāo)物C1從C1-H1中置換下來(lái)，引發(fā)新一輪CHA反應(yīng)，生成大量雙鏈DNA產(chǎn)物H1-H2。由于CHA反應(yīng)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、背景低等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)被廣泛用于miRNA檢測(cè)以及活細(xì)胞內(nèi)成像[20]。例如：Liu課題組基于CHA反應(yīng)提出了一種簡(jiǎn)單的熒光方法用于檢測(cè)miRNA，通過(guò)miRNA引發(fā)發(fā)夾探針之間發(fā)生CHA反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了1 pmol/L的檢測(cè)限[21]；Wang課題組基于金納米粒子和CHA反應(yīng)構(gòu)建了一種納米信標(biāo)用于活細(xì)胞中miRNA的成像(圖2B)[22]，無(wú)target存在時(shí)，金納米粒子與其表面修飾的熒光探針H1發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，熒光猝滅，target存在并打開發(fā)夾H1后，熒光團(tuán)和金納米粒子相互遠(yuǎn)離，熒光恢復(fù)。隨后，發(fā)夾H2與被打開的發(fā)夾H1雜交，并置換出target參與新一輪CHA反應(yīng)，產(chǎn)生擴(kuò)增的熒光信號(hào)用于miR-21檢測(cè)。然而，這些傳統(tǒng)的CHA反應(yīng)主要是基于熒光團(tuán)或者金納米粒子標(biāo)記，存在擴(kuò)增不充分、檢測(cè)靈敏度低等缺點(diǎn)，因此限制了CHA反應(yīng)的廣泛應(yīng)用。

為了解決上述傳統(tǒng)CHA反應(yīng)所面臨的問(wèn)題，研究者們將CHA反應(yīng)與其他的擴(kuò)增模塊(例如HCR)整合在一起，提高了檢測(cè)靈敏度。Wang等基于CHA和HCR發(fā)展了一種級(jí)聯(lián)CHA-HCR電路，用于信號(hào)擴(kuò)增及胞內(nèi)成像(圖2C)[23]，該擴(kuò)增電路包含兩部分，上游CHA擴(kuò)增電路和下游HCR擴(kuò)增電路。在上游CHA電路中，目標(biāo)物Ⅰ引發(fā)發(fā)夾反應(yīng)物H1和H2發(fā)生反應(yīng)，生成大量的雙鏈DNA產(chǎn)物，并暴露出序列T作為下游HCR電路的輸入信號(hào)，引發(fā)發(fā)夾反應(yīng)物H3、H4、H5和H6發(fā)生HCR反應(yīng)，最終形成長(zhǎng)的雙鏈DNA納米線，使得大量的熒光團(tuán)與猝滅劑相互靠近發(fā)生FRET，產(chǎn)生顯著的FRET信號(hào)。這些將CHA反應(yīng)與其他擴(kuò)增模塊整合的新方法。利用級(jí)聯(lián)電路的協(xié)同擴(kuò)增能力提高了檢測(cè)的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)miRNA的精準(zhǔn)成像。

圖2 (A)CHA反應(yīng)原理[19];(B)發(fā)夾驅(qū)動(dòng)的納米信標(biāo)用于miRNA成像的原理圖[22]；(C)級(jí)聯(lián)CHA-HCR電路用于miRNA檢測(cè)的工作原理[23]Fig.2 (A) The principle of CHA[19];(B) Schematic illustration of hairpin-fuelled catalytic nanobeacons for miR-21 imaging[22];(C) The principle of concatenated CHA-HCR circuit for miRNA detection[23]

2.3 核酸酶(DNAzyme)用于miRNA檢測(cè)

核酸酶(DNAzyme)是一種具有催化性能的單鏈核酸。在輔因子存在時(shí)，DNAzyme能夠催化剪切RNA底物或者DNA底物，是一種很有前景的信號(hào)放大器。Willner課題組基于DNAzyme構(gòu)建了一種熒光傳感器用于目標(biāo)物的檢測(cè)(圖3A)[24]，目標(biāo)物T引發(fā)發(fā)夾反應(yīng)物Ⅱ打開，并暴露出toehold進(jìn)一步與反應(yīng)物Ⅰ堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成DNAzyme結(jié)構(gòu)，在Mg2+存在時(shí)，DNAzyme催化剪切發(fā)夾底物S，使得S上修飾的熒光團(tuán)與猝滅劑分開，產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的擴(kuò)增檢測(cè)。此外，DNAzyme能夠與其他擴(kuò)增方法(如HCR、CHA)整合以提高檢測(cè)靈敏度。如：Yang等將CHA與DNAzyme耦合發(fā)展了一個(gè)雙重態(tài)的CHA-DNAzyme體系，用于miRNA分析及成像(圖3B)[25]。目標(biāo)物T1引發(fā)發(fā)夾反應(yīng)物H1和H2發(fā)生CHA反應(yīng)，產(chǎn)生大量的含有DNAzyme結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA產(chǎn)物H1-H2，隨后，DNAzyme催化剪切熒光團(tuán)/猝滅劑修飾的底物S，得到一個(gè)放大的熒光輸出信號(hào)，提高了檢測(cè)靈敏度。為了進(jìn)一步提高miRNA檢測(cè)的靈敏度，Wu等將DNAzyme結(jié)構(gòu)作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)單元引入到級(jí)聯(lián)HCR反應(yīng)體系中，設(shè)計(jì)了一個(gè)級(jí)聯(lián)HCR-DNAzyme擴(kuò)增器用于細(xì)胞外囊泡相關(guān)的miRNA的識(shí)別[26]。如圖3C所示，該擴(kuò)增器包含上游HCR1、下游HCR2和DNAzyme三個(gè)擴(kuò)增模塊。靶標(biāo)Ⅰ觸發(fā)上游HCR1反應(yīng)物H1和H2自主交叉組裝，形成HCR1雙鏈DNA納米線，并暴露出序列T引發(fā)下游HCR2發(fā)夾反應(yīng)物H3、H4、H5和H6自組裝，形成含有大量DNAzyme結(jié)構(gòu)的納米線，在輔因子存在時(shí)，激活DNAzyme剪切熒光團(tuán)/猝滅劑修飾的底物S，輸出熒光信號(hào)，級(jí)聯(lián)HCR和DNAzyme的協(xié)同放大顯著地提高了miRNA的檢測(cè)靈敏度，miRNA檢測(cè)限低至0.3 pmol/L，為癌癥早期診斷開辟了一條新途徑。Wang等進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一個(gè)由起始CHA擴(kuò)增單元、中間HCR擴(kuò)增單元以及末端DNAzyme擴(kuò)增單元構(gòu)成的級(jí)聯(lián)CHA-HCR-DNAzyme擴(kuò)增體系，用于miRNA的檢測(cè)以及胞內(nèi)成像(圖3D)[27]。目標(biāo)物Ⅰ引發(fā)CHA擴(kuò)增模塊中的發(fā)夾反應(yīng)物H1和H2自組裝，形成雙鏈DNA中間產(chǎn)物H1-H2，并暴露出序列T進(jìn)一步引發(fā)發(fā)夾反應(yīng)物H3、H4、H5和H6發(fā)生HCR反應(yīng)，得到含有DNAzyme結(jié)構(gòu)的串聯(lián)納米線。最后，Mg2+-活化的DNAzyme擴(kuò)增單元催化裂解熒光團(tuán)/猝滅劑修飾的底物，產(chǎn)生熒光擴(kuò)增信號(hào),該CHA-HCR-DNAzyme放大系統(tǒng)通過(guò)多重?cái)U(kuò)增實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的擴(kuò)增檢測(cè)。這種將DNAzyme整合到其他擴(kuò)增單元的新方法，能夠提高信號(hào)擴(kuò)增效率，進(jìn)而改善miRNA的檢測(cè)靈敏度。

圖3 (A)DNAzyme用于目標(biāo)物檢測(cè)的反應(yīng)原理[24]；(B)級(jí)聯(lián)CHA-DNAzyme電路的主要原理[25]；(C)級(jí)聯(lián)HCR-HCR-DNAzyme電路用于miRNA分析的原理圖[26]；(D)級(jí)聯(lián)CHA-HCR-DNAzyme核酸電路用于miRNA檢測(cè)的原理[27]Fig.3 (A) The principle of DNAzyme for analyte detection[24];(B) Schematic illustration of concatenated CHA-DNAzyme circuit[25];(C) The principle of concatenated HCR-HCR-DNAzyme circuit for miRNA analysis[26];(D) The principle of CHA-HCR-DNAzyme circuit for miRNA detection[27]

為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，可以拓展DNAzyme的生物催化功能，進(jìn)而開發(fā)新型檢測(cè)傳感器用于miRNA的檢測(cè)以及細(xì)胞內(nèi)成像。為此，一些DNAzyme與其他擴(kuò)增方法整合所構(gòu)建的交叉自催化線路被相繼報(bào)道。如：Zou等將DNAzyme和CHA集成設(shè)計(jì)了一個(gè)交叉催化CHA-DNAzyme電路用于miRNA檢測(cè)及成像(圖4A)[28]。目標(biāo)物T在發(fā)夾反應(yīng)物H1和H2之間引發(fā)CHA反應(yīng)，使得發(fā)夾H2上修飾的熒光團(tuán)和猝滅劑相互遠(yuǎn)離，輸出熒光信號(hào)，同時(shí)，生成大量含有DNAzyme結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA產(chǎn)物。隨后，DNAzyme結(jié)構(gòu)催化裂解對(duì)應(yīng)的雙鏈底物S/L，釋放出目標(biāo)物序列T，引發(fā)新一輪CHA反應(yīng)。該方法極大地提高了CHA反應(yīng)的擴(kuò)增能力，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)miRNA的靈敏成像。然而，該方法利用轉(zhuǎn)染試劑運(yùn)載核酸探針，存在轉(zhuǎn)染效率低等問(wèn)題。為了解決這一問(wèn)題，Wei等利用蜂窩狀MnO2納米海綿作為載體，基于HCR和DNAzyme擴(kuò)增模塊的協(xié)同交叉活化作用，構(gòu)建了一個(gè)持續(xù)自催化的DNAzyme生物電路用于體內(nèi)miRNA擴(kuò)增成像(圖4B)[29]。目標(biāo)物miRNA引發(fā)發(fā)夾反應(yīng)組分H1、H2、H3和H4發(fā)生HCR反應(yīng)，使得發(fā)夾反應(yīng)物H2和H4上修飾的熒光團(tuán)和猝滅劑相互靠近發(fā)生FRET，同時(shí)得到含有DNAzyme結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA產(chǎn)物。在輔因子作用下，DNAzyme自催化剪切雙鏈復(fù)合底物S/L，產(chǎn)生大量與目標(biāo)物相同的序列，可逆引發(fā)新一輪HCR反應(yīng)。在該電路中，蜂窩狀MnO2納米海綿不僅可以作為載體將DNA發(fā)夾探針運(yùn)送到細(xì)胞中，而且能夠被細(xì)胞中的GSH降解，提供Mn2+作為DNAzyme擴(kuò)增單元的輔因子和磁共振成像試劑。MnO2載體提供的輔因子解決了細(xì)胞內(nèi)DNAzyme模塊自身催化效率低等問(wèn)題。此外，經(jīng)過(guò)HCR與DNAzyme擴(kuò)增模塊的交叉反饋過(guò)程，有限的靶標(biāo)miRNA識(shí)別信號(hào)被放大輸出，實(shí)現(xiàn)了miRNA的靈敏檢測(cè)以及體內(nèi)精準(zhǔn)成像。這些交叉自催化線路通過(guò)自提供DNAzyme輔因子，解決了DNAzyme催化效率低的問(wèn)題，從而提高了miRNA檢測(cè)的靈敏度，在癌癥早期診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。

圖4 (A)交叉自催化CHA-DNAzyme線路的反應(yīng)原理[28]；(B)自催化DNAzyme生物電路用于體內(nèi)miR-21擴(kuò)增成像[29]Fig.4 (A) The principle of the cross-catalytic CHA-DNAzyme circuit[28];(B) Scheme of the autocatalytic DNAzyme biocircuit for in vivo amplified miR-21 imaging[29]

3 總結(jié)與展望

在這篇綜述中，我們總結(jié)了一些基于恒溫?zé)o酶核酸擴(kuò)增的miRNA分析方法。miRNA作為一種潛在的癌癥標(biāo)志物，對(duì)于癌癥早期診斷以及預(yù)后治療意義重大。考慮到miRNA具有序列短、序列相似度高、豐度低等特點(diǎn)，miRNA的高靈敏度和高特異性檢測(cè)是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。盡管科學(xué)家們經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的努力已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是仍然存在一些需要解決的問(wèn)題：(1)目前雖然已經(jīng)報(bào)道了許多恒溫核酸擴(kuò)增方法用于miRNA檢測(cè)，但是實(shí)際可行且商業(yè)化的方法主要還是依賴PCR。因此，基于恒溫?zé)o酶核酸擴(kuò)增發(fā)展簡(jiǎn)單靈敏的方法，用于實(shí)際樣本中miRNA的檢測(cè)具有良好的發(fā)展?jié)摿Α?2)通常情況下，一種疾病通常與多種miRNA的異常表達(dá)有關(guān)。因此，發(fā)展高通量的miRNA檢測(cè)方法對(duì)于提高癌癥早期診斷的準(zhǔn)確性是極其重要的。為了解決這些問(wèn)題，亟需開發(fā)出高通量、高靈敏度及高特異性的方法，用于活細(xì)胞中miRNA的分析。