范埡玲，田智全,2，龐代文，張志凌*

(1.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072；2.西藏大學(xué)理學(xué)院，西藏拉薩 850000)

1 前言

20世紀50年代，Weber首次將熒光各向異性法應(yīng)用于生化分析領(lǐng)域，用于牛血清白蛋白和卵白蛋白的相互作用研究[1]。之后，熒光各向異性方法的研究越來越受到重視[2]。

上世紀80年代，隨著熒光探針和熒光各向異性分析儀器的商業(yè)化，熒光各向異性技術(shù)在生命科學(xué)等各個領(lǐng)域扮演著越來越重要的角色[3-5]。歸其原因主要有：(1)熒光各向異性分析屬于均相分析，不需要分離、洗滌步驟，操作簡便[6,7]；(2)可直接、實時測定熒光探針的結(jié)合/解離速率[8]；(3)易于實現(xiàn)高通量、自動化分析[9-11]；(4)探針設(shè)計簡單，只需要一個熒光分子標記[12]。然而，由于檢測目標分子的體積或質(zhì)量很小，與探針結(jié)合不能引起明顯的熒光各向異性值的改變，因此研究者們采用一些熒光各向異性信號放大策略來解決這一問題，從而大大提高了該方法的靈敏度。本文對熒光各向異性法的檢測原理和信號放大策略展開綜述。

2 熒光各向異性法的檢測原理

2.1 基本原理

熒光各向異性是熒光分子的固有屬性。當(dāng)熒光分子定向排列后，熒光分子發(fā)出的熒光具有各向異性。此時，用取向垂直和水平的檢偏器就會檢測到不同的熒光強度。

1920年，Perrin等對這一現(xiàn)象進行理論研究，并提出了關(guān)于熒光各向異性值(r)的Perrin方程。對于熒光壽命值固定的熒光分子，若它在介質(zhì)中保持靜止不旋轉(zhuǎn)狀態(tài)，r非常大，趨近于1；若它在介質(zhì)中自由旋轉(zhuǎn)，r趨近于0。Perrin方程表明r值的大小與熒光分子的旋轉(zhuǎn)運動狀態(tài)有關(guān)，如下式：

(1)

(2)

其中，r為所測得的熒光各向異性值，r0為內(nèi)在各向異性，τ為熒光壽命，θ為旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度，η為溶液粘度，V為旋轉(zhuǎn)體的體積。

由Perrin方程(1)和(2)可知，當(dāng)熒光壽命、溶液的粘度和溫度保持不變時，熒光體的體積(或質(zhì)量)增大時，熒光各向異性值增大；當(dāng)熒光體的體積(或質(zhì)量)減小時，熒光各向異性值減小[13-15]。通過反應(yīng)前后熒光體的分子體積(或質(zhì)量)的顯著改變可實現(xiàn)目標分子的高靈敏檢測。然而檢測目標分子的體積通常很小，與熒光探針結(jié)合后不能引起熒光各向異性值的顯著改變。因此，研究如何放大熒光各向異性信號，實現(xiàn)生物分子的高靈敏檢測成為研究熱點。

2.2 熒光各向異性探針

由Perrin方程(1)可知，熒光各向異性探針的熒光壽命(τ)應(yīng)與目標分子的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間(θ)具有相同的數(shù)量級。因此，在熒光各向異性分析中，熒光各向異性探針的選擇也非常關(guān)鍵。

基于熒光團的性質(zhì)，熒光各向異性探針主要分為三類，如圖1所示。第一類是有機染料，例如Alexa Fluor488(AF488)、四甲基羅丹明(TMR)、熒光素(發(fā)射波長：500～600 nm)，尼羅藍(Nile Blue)、德克薩斯紅(發(fā)射波長：600～700 nm)等[16-24]。這些熒光染料具有良好的性能，如高量子產(chǎn)率、良好的穩(wěn)定性和易偶聯(lián)等。然而上述有機染料的熒光會受到樣品基質(zhì)的藍/綠色背景熒光的干擾[25]。因此，有機染料的熒光各向異性探針大部分只適用于緩沖溶液或稀釋血清，難于用于復(fù)雜生物樣品中，如全血等。第二類是過渡金屬配位化合物，主要是發(fā)射波長在600～700 nm范圍的釕(Ⅱ)螯合物[26]。釕(Ⅱ)螯合物熒光壽命較長，有利于區(qū)分探針-目標分子復(fù)合物與游離探針間的熒光各向異性值差異。最后一類是熒光納米粒子，其發(fā)射波長范圍為500～1 500 nm，主要包括染料摻雜的納米粒子和量子點(QDs)[27-32]。

圖1 熒光各向異性探針的種類Fig.1 Types of fluorescent anisotropic probes

近紅外熒光由于具有穿透組織深，組織和血液的散射小，吸收和自發(fā)熒光的干擾小的優(yōu)勢，在體內(nèi)成像領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[33]。近紅外熒光各向異性探針也引起了研究者極大的興趣[34,35]。例如，Deng等制備了一種亞甲基藍摻雜的近紅外熒光納米顆粒，并構(gòu)建近紅外熒光各向異性探針，實現(xiàn)了全血樣品中的甲胎蛋白(AFP)和急性白血病細胞的含量檢測[31,32]。QDs是具有巨大潛力的熒光各向異性探針，特別是發(fā)射波長在第二近紅外窗口(NIR-Ⅱ，1 000～1 500 nm)的近紅外QDs[36,37]。與熒光有機染料相比，QDs具有光穩(wěn)定性好、發(fā)射光譜窄、尺寸可調(diào)、自發(fā)熒光干擾小等諸多優(yōu)勢[33]。近紅外二區(qū)QDs的熒光各向異性探針在復(fù)雜基質(zhì)方面具有廣闊前景。我們實驗室已經(jīng)成功制備了各種類型近紅外QDs，例如Ag2Te QDs、Ag2S QDs和Ag2Se QDs等[38-41]。

3 熒光各向異性信號放大策略

傳統(tǒng)熒光各向異性分析是基于熒光各向異性探針與目標分子結(jié)合后引起的質(zhì)量發(fā)生變化[3,14,28]。但是，對于小分子分析物，很難得到有效的熒光各向異性信號變化。近年來，研究人員開發(fā)了各種熒光各向異性信號放大策略。從熒光各向異性方法的檢測原理可以看出，熒光各向異性值與結(jié)合物質(zhì)量，結(jié)合物的熒光壽命和結(jié)合物的旋轉(zhuǎn)運動自由程度有關(guān)?；诖?，熒光各向異性放大策略可分為以下三類，其示意圖如圖2所示。

圖2 熒光各向異性信號放大策略的示意圖。(1)分子質(zhì)量；(2)熒光分子的自由轉(zhuǎn)動程度；(3)熒光壽命Fig.2 Schematic representation of fluorescence anisotropic signal amplification strategy.(1) Mass amplifying strategy；(2) Degree of free rotation of fluorescent molecules；(3) Fluorescence lifetime

3.1 分子質(zhì)量放大熒光各向異性信號

當(dāng)溫度及溶液的粘度一定，熒光分子質(zhì)量是影響熒光各向異性值的最重要的原因之一。由于目標分子的分子質(zhì)量比較小，通常引入分子質(zhì)量較大且穩(wěn)定性好的材料作為熒光各向異性信號放大器，例如蛋白質(zhì)、金納米顆粒(Au NPs)、氧化石墨烯(GO)等。

3.1.1 蛋白質(zhì)放大熒光各向異性信號蛋白質(zhì)是一類生物大分子，生物相容性好，具有較大的分子質(zhì)量和體積，能夠增強與之結(jié)合的熒光體的熒光各向異性信號。單鏈結(jié)合蛋白(Single-Strand Binding Proteins,SSB)，又名DNA結(jié)合蛋白，參與DNA復(fù)制過程，分子量約為70 kDa[42,43]。

Pryrin課題組[44]將SSB作為熒光各向異性信號放大器，實現(xiàn)了小分子ATP的檢測。之后Yang等[45]將凝血酶(分子量約為37 kDa)作為質(zhì)量放大器，設(shè)計了一種功能化核酸探針，其中包含ATP的核酸適配體(熒光素標記)、凝血酶的核酸適配體和阻斷鏈。當(dāng)目標靶物不存在時，探針的阻斷鏈將無法被取代，探針的結(jié)構(gòu)也未發(fā)生任何改變，因此熒光各向異性信號不會發(fā)生改變。加入ATP之后，ATP與核酸適配體特異性結(jié)合使阻斷鏈從探針上解鏈，并暴露凝血酶的核酸適配體部分。此時，凝血酶與核酸適配體結(jié)合，從而引起探針部分的分子量顯著增大，熒光各向異性值增大。通過熒光各向異性值的變化量實現(xiàn)對小分子ATP的定量檢測。

Tian等[46]將常用的熒光素標記物換為CdTe-CdS QDs，利用特異性抗原抗體反應(yīng)放大熒光各向異性信號，實現(xiàn)ATP的高靈敏檢測。在QDs的表面偶聯(lián)捕獲DNA鏈，捕獲修飾有地高辛抗原的ATP核酸適配體，然后與抗體特異性結(jié)合形成復(fù)合物。加入ATP之后，核酸適配體從復(fù)合物上解離與ATP結(jié)合，此時QDs表面只剩下捕獲DNA鏈，熒光各向異性值顯著減小。通過蛋白質(zhì)放大熒光各向異性信號，熒光各向異性值變化范圍一般在0.03以下，檢測限通常為μmol/L水平，其檢測的靈敏度還有待提高[47-51]。

3.1.2 納米材料放大熒光各向異性信號與蛋白質(zhì)相比，納米材料具有很多優(yōu)勢，如熱穩(wěn)定性好、較大的體積和質(zhì)量、易于合成及表面修飾等。因此納米材料被用于放大熒光各向異性信號,如Au NPs、Ag NPs、聚苯乙烯納米顆粒(PS NPs)和SiO2NPs等[52-57]。Ye等[58]提出利用Au NPs增強熒光各向異性信號實現(xiàn)金屬離子的高靈敏度檢測。該方法對Hg2+的檢測限為1 nmol/L,與不使用Au NPs的情況相比檢測限降低2個數(shù)量級。在此基礎(chǔ)上，Ye課題組[59]將DNA酶反應(yīng)信號放大技術(shù)與Au NPs結(jié)合，實現(xiàn)了對Cu2+和Pb2+的檢測。同樣，Gao等[60]也通過Au NPs實現(xiàn)對細胞內(nèi)端粒酶活性的快速檢測。另外，Tian課題組[28]利用Au NPs放大熒光各向異性信號，通過抗原抗體作用形成復(fù)合物，實現(xiàn)對ATP的檢測，檢測限低至1.8 pmol/L。

除了Au NPs外，科研工作者還將其它納米顆粒用于熒光各向異性信號放大。Yue等[61]利用三明治結(jié)構(gòu)，引入SiO2NPs作為熒光各向異性信號放大器，實現(xiàn)了0.2 nmol/L凝血酶的檢測。Qiu等[52]通過鏈酶親和素(Streptavidin,SA)和SiO2NPs結(jié)合共同放大熒光各向異性信號，實現(xiàn)乙型肝炎病毒的檢測，其檢出限為0.65 nmol/L。Huang等[55]將級聯(lián)鏈置換擴增反應(yīng)與PS NPs二者結(jié)合增強熒光各向異性信號，成功實現(xiàn)對凝血酶的超靈敏檢測，檢測限可達28 amol/L，與常規(guī)檢測方法相比降低了6個數(shù)量級。將納米顆粒作為熒光各向異性信號放大器可成功地實現(xiàn)了目標物的高靈敏檢測。但是上述方法都需要將DNA通過化學(xué)作用修飾到納米顆粒表面，其過程比較復(fù)雜，另外納米顆粒屬于零維納米材料，增加的分子量也相對有限。

一些獨特的二維納米材料很好地解決以上問題，如碳納米材料[62-65]、MoS2[66]和TiS2[67]等。DNA可通過π-π堆積作用和范德華力吸附到氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)表面[68-72]。GO具有大體積和獨特的旋轉(zhuǎn)運動特性，因此與探針結(jié)合時會放大熒光各向異性信號[73]。Tan課題組[63]將修飾有熒光素的單鏈核酸適配體探針通過π-π作用吸附在GO的表面，由于GO質(zhì)量大、體積大使得熒光體轉(zhuǎn)動較慢，熒光各向異性值變大。加入目標物ATP之后，核酸適配體脫離GO的表面與目標物結(jié)合從而使熒光各向異性值減小。Huang等[74]將GO和酶切循環(huán)放大二者結(jié)合設(shè)計熒光各向異性探針，實現(xiàn)了ATP的超靈敏度檢測，檢測限可達2 pmol/L。由于熒光探針與GO作用較強，不易從GO表面脫離，檢測靈敏度受到一定限制[75]，Xiao等引進捕獲DNA改變熒光探針與GO的結(jié)合方式，使探針更易從GO表面釋放，并結(jié)合一系列循環(huán)放大策略，實現(xiàn)了對蓖麻素和microRNA的檢測[76-78]。Zhao等[79]利用碳納米管放大熒光各向異性信號，實現(xiàn)定量檢測分析甲基轉(zhuǎn)移酶的活性及其抑制劑。

二維納米材料可以明顯放大熒光各向異性信號(熒光各向異性值變化范圍在0.15～0.35以內(nèi))，提高檢測靈敏度。但也存在一些問題，如熒光各向異性探針的熒光易被GO猝滅，探針不易從GO的表面脫離，從而限制了檢測靈敏度[80,81]。

3.2 熒光分子自由轉(zhuǎn)動程度放大熒光各向異性

當(dāng)熒光分子與生物大分子結(jié)合時，熒光各向異性值會受復(fù)合物的自由轉(zhuǎn)動程度影響。熒光分子與質(zhì)量大的分子的距離越近，其自由轉(zhuǎn)動能力越差，熒光各向異性值越大。Wang等[82]利用核酸適配體上熒光基團與凝血酶距離的變化而引起的熒光各向異性值變化，在單個堿基水平研究核酸適配體與目標蛋白的作用過程，為揭示適配體與靶分子作用的機理提供了理論支持。Zhang等[83]利用此原理實現(xiàn)了對凝血酶的高靈敏檢測，檢測限達250 pmol/L。Perrier等[84]也利用類似放大策略實現(xiàn)了ATP的檢測。該放大策略的優(yōu)勢在于通過核酸適配體構(gòu)像變化直接檢測目標物，檢測限通常比基于質(zhì)量放大策略低。

3.3 熒光壽命放大熒光各向異性信號

由Perrin方程可知，熒光各向異性值除了與熒光分子的質(zhì)量和體積及自由轉(zhuǎn)動程度等有關(guān)，還與熒光壽命有關(guān)。如果熒光分子的熒光壽命較長，隨著分子的快速轉(zhuǎn)動，熒光就可能在各個方向上均勻分布，降低熒光各向異性值。

Wang小組[85]利用該原理研究了G-四鏈體(G-quadruplex)結(jié)構(gòu)的形成對熒光各向異性變化的影響。當(dāng)DNA單鏈沒形成G-四鏈體時，DNA上修飾的熒光分子與相鄰的堿基G發(fā)生分子內(nèi)作用，熒光被猝滅；當(dāng)形成G-四鏈體時，DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，由于空間位阻等因素?zé)晒夥肿訜o法與堿基G作用，熒光得以恢復(fù)，熒光壽命增加0.56 ns。該課題組利用該策略實現(xiàn)了對小分子赭曲霉素的檢測，檢測限為3 nmol/L[86]。Chovelon等用SYBR Green染料作為熒光標記物，研究了其在游離態(tài)與DNA結(jié)合時熒光各向異性值的變化[87]。由于SYBR Green染料的熒光壽命(皮秒范圍)比其旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間(亞納秒范圍)小，游離SYBR Green的熒光各向異性非常大，約為0.3。與DNA結(jié)合后，熒光壽命增加，熒光各向異性值減小。當(dāng)加入目標物后，目標物與SYBR Green競爭結(jié)合DNA，導(dǎo)致大量SYBR Green呈游離狀態(tài)，熒光各向異性值改變。該方法具有簡單易行、普適性、快速等優(yōu)勢，但是熒光各向異性信號微弱，影響檢測的準確度。

4 結(jié)論和展望

熒光各向異性檢測屬于均相分析方法，具有快速、準確性高、重復(fù)性好的特點，是一種可靠且優(yōu)越的檢測方法。該方法可應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，如：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用研究，藥物輸運，食品安全檢測以及環(huán)境監(jiān)測等。針對小分子的熒光各向異性信號放大策略，包括分子質(zhì)量增強，熒光分子的自由旋轉(zhuǎn)和熒光壽命調(diào)控。這些方法各有優(yōu)缺點，在一定程度上放大了熒光各向異性信號，但是檢測靈敏度還有待進一步提高。

基質(zhì)自發(fā)熒光一直是影響檢測方法準確性的難題?；|(zhì)自發(fā)熒光來源復(fù)雜生物樣品中的某些蛋白質(zhì)或熒光分子。近年來，近紅外熒光納米材料(發(fā)射波長為700～1 500 nm甚至更大)引起研究者的廣泛關(guān)注。近紅外熒光各向異性探針可能會大大降低基質(zhì)的自發(fā)熒光效應(yīng)。因此，近紅外熒光各向異性探針有望在復(fù)雜樣品(包括全血，未稀釋的細胞裂解緩沖液和尿液)中實現(xiàn)快速免分離分析。

熒光各向異性分析的優(yōu)勢可以滿足復(fù)雜樣品現(xiàn)場檢測的需求。因此，熒光各向異性分析在復(fù)雜生物基質(zhì)即時檢驗(POCT)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。