劉香梅，曹俊濤，劉彥明

(信陽師范學院化學化工學院，河南信陽 464000)

1 引言

電化學發(fā)光(Electrochemiluminescence，ECL)具有背景信號低、靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快和反應(yīng)可控性、時空可控性好等優(yōu)點。目前，基于ECL構(gòu)建的生物傳感器已廣泛應(yīng)用于檢測金屬離子[1]、小分子[2]、DNA/RNA[3,4]、蛋白質(zhì)[5,6]及細胞[7,8]等，在分析科學中起著越來越重要的作用。

2005年，Liu和Tian[9]提出檢測Hg2+的比率型熒光化學計量方法。2013年，Zhang等[10]利用CdS納米晶和luminol發(fā)光電位的不同，首次構(gòu)建了檢測mp53致癌基因的雙電位比率型ECL傳感器。在該傳感器中，CdS納米晶ECL信號猝滅和luminol ECL信號增強反映出的是同一生物結(jié)合過程，利用二者信號比值進行定量分析，有效提高了檢測的準確度。

近年來，比率型的ECL生物傳感器進展迅速，不同類型的比率型ECL傳感器已應(yīng)用于金屬離子[11,12]、DNA/RNA[13,14]、蛋白質(zhì)[15]、細胞[16,17]等的分析。目前，比率型ECL生物傳感器可分為雙電位比率型ECL傳感器、雙波長比率型ECL傳感器和內(nèi)參比比率型ECL傳感器。本文綜述了近年來不同類型比率型ECL生物傳感器及其應(yīng)用進展，對未來發(fā)展前景進行了討論。

2 雙電位比率型ECL生物傳感器

雙電位比率型ECL生物傳感器是指在一定的底物濃度下，兩個獨立的ECL發(fā)射態(tài)隨目標物濃度直接或間接變化，利用兩個ECL強度的比值進行定量的一類傳感器。目前，實現(xiàn)雙電位比率型ECL傳感分析的主要策略有共振能量轉(zhuǎn)移、共反應(yīng)劑濃度調(diào)控等。

2.1 共振能量轉(zhuǎn)移策略

ECL共振能量轉(zhuǎn)移(ECL-RET)是指ECL供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有重疊，且二者之間的距離小于10 nm時，供體被激發(fā)后發(fā)射的光可被受體吸收，從而將供體的能量轉(zhuǎn)移給受體，使供體的ECL信號降低的一個能量傳遞過程。2013年，Zhang等[10]利用CdS納米晶和luminol為發(fā)光材料率先實現(xiàn)了雙電位比率型ECL傳感器對mp53致癌基因的檢測。在此工作中，CdS納米晶的發(fā)光電位為-1.25 V(vs.SCE)，luminol的發(fā)光電位為+0.45 V(vs.SCE)，二者的電位差較大，可實現(xiàn)一次掃描產(chǎn)生兩個獨立的ECL信號。該工作中l(wèi)uminol與Pt NPs復(fù)合在一起，Pt NPs的存在起到了兩方面的作用：一是可與CdS納米晶發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，猝滅CdS納米晶的ECL信號；二是Pt NPs可負載更多的luminol且可催化H2O2從而增強luminol的ECL信號，通過CdS納米晶和luminol信號的比值，實現(xiàn)對mp53致癌基因的準確、靈敏檢測，檢出限為1.7 fmol/L，線性范圍為5～1 000 fmol/L。納米花狀的CdS-C(CdS-C NFs)最大ECL發(fā)射波長為535 nm，而luminol-Au NPs在535 nm處有明顯的紫外吸收，因此，二者可發(fā)生RET。我們課題組[18]借此設(shè)計了一個以CdS-C NFs和luminol-Au NPs為陰、陽極發(fā)光材料的比率型ECL傳感器，檢測了癌胚抗原(CEA)。當不存在CEA時，與CdS-C NFs相連的cDNA和與luminol-Au NPs相連的CEA適配體(APT)通過堿基互補配對將二者固定在同一個界面上，可發(fā)生RET；當存在CEA時，APT與CEA特異性結(jié)合，使luminol-Au NPs遠離電極表面，RET被破壞，從而使CdS-C NFs的ECL增強，luminol-Au NPs的ECL信號減弱，實現(xiàn)了對CEA的靈敏檢測，原理見圖1。此傳感器檢出限為0.033 pg/mL，線性范圍為0.1 pg/mL～10 ng/mL，應(yīng)用于癌癥病人血清檢測，加標回收率為90%～110%。

圖1 ECL-RET比率型傳感器對CEA的檢測原理圖[18]Fig.1 Schematic illustration of the ECL-RET ratiometric sensor for CEA detection[18]

g-C3N4和Ru-MOF的發(fā)光電位分別為-1.5 V和+1.1 V，電位差較大。Wang等[19]分別以g-C3N4和Ru-MOF為陰、陽極發(fā)光材料構(gòu)建了ECL傳感器。g-C3N4的最大熒光發(fā)射波長為450 nm，Ru-MOF在450 nm處有紫外吸收峰，兩個波譜重疊，因此二者之間可實現(xiàn)RET效應(yīng)，從而對β-amyloid進行靈敏檢測，檢出限為3.9 fg/mL，線性范圍為1.0×10-5～500 ng/mL，加標回收率為99.2%～103%，原理見圖2。

圖2 g-C3N4-Ru-MOF雙電位比率型的ECL生物傳感器的機理圖[19]Fig.2 Schematic diagram of the potential resolution ratiometric ECL biosensor based on g-C3N4 nanosheet and Ru-MOF[19]

2.2 調(diào)控共反應(yīng)劑濃度策略

調(diào)控共反應(yīng)劑濃度是通過貴金屬納米粒子或納米簇、酶改變共反應(yīng)劑或參與發(fā)光反應(yīng)的自由基的濃度來改變ECL信號強度實現(xiàn)比率分析。2016年，Huang課題組[28]分別以CdS QDs和luminol為陰、陽極發(fā)光材料，設(shè)計了一個通過競爭H2O2來檢測CEA的傳感器。在此傳感器中，負載luminol和Pt納米簇的氧化石墨烯(luminol/Pd NCs@GO)一方面對H2O2產(chǎn)生較強的電催化還原作用導致CdS QDs的ECL信號強度降低；另一方面，Pd NCs對H2O2的催化作用可加速luminol的ECL過程，增強luminol的ECL信號。通過二者的比值，實現(xiàn)了對CEA的靈敏檢測，檢出限0.62 pg/mL，線性范圍為1.0～100 pg/mL。Zhang等[29]則以G-CdTe和苯氧基衍生物葡聚糖-Au-Pt納米粒子-異魯米諾(Dexp-Au-Pt-ABEI)為陰、陽極發(fā)光材料，通過競爭溶解氧設(shè)計了一個檢測伴刀豆蛋白(Con A)的傳感器。這些方法均是基于貴金屬對共反應(yīng)劑的催化引起兩種發(fā)光劑信號強度的變化來實現(xiàn)比率分析的。

Chen研究組[30]分別以RGO-CdTe QDs和羧基聚合物點(PFO dots)為陰、陽極發(fā)光材料，以溶解氧為RGO-CdTe QDs的共反應(yīng)劑，酶反應(yīng)生成的H2O2為PFO dots的共反應(yīng)劑，檢測有機磷殺蟲劑(OPs)(圖3)。當由乙酰膽堿酶(AChE)和膽堿氧化酶(ChOx)誘導的猝滅反應(yīng)發(fā)生時，由于溶解氧的消耗，來自RGO-CdTe QDs的陰極ECL信號處于“signal off”狀態(tài)；同時，由于H2O2的生成，導致PFO dots的陽極ECL信號處于“signal on”狀態(tài)。當目標物OPs存在時，AChE的酶活性被抑制，陰極ECL信號增強，陽極ECL信號降低，可用CdTe QDs與PFO dots的比值對OPs進行定量分析，OPs檢出限低至1.25×10-13mol/L，線性范圍為5.0×10-13～1.0×10-8mol/L。該課題組[31]還以rGO-CdTe QDs和luminol為發(fā)光試劑，分別以酶反應(yīng)過程中的反應(yīng)物溶解氧和產(chǎn)物H2O2為共反應(yīng)劑，基于酶反應(yīng)誘發(fā)的反應(yīng)物和產(chǎn)物濃度變化，實現(xiàn)兩個發(fā)光劑ECL信號強度反向改變，從而實現(xiàn)次黃嘌呤的比率檢測。Jiang小組[32]利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖過程中對溶解氧的消耗以及H2O2的生成，以Au-g-C3N4和luminol為發(fā)光試劑構(gòu)建了檢測葡萄糖的ECL比率方法。這些方法都是基于酶催化反應(yīng)過程中共反應(yīng)劑的濃度變化引起兩種發(fā)光劑信號強度的變化實現(xiàn)比率分析的。

圖3 PFO-CdTe QDs檢測有機磷的原理圖[30]Fig.3 Schematic illustration for OPs detection by using PFO dots and CdTe QDs[30]

此外，Shao等[33]利用Au-Hemin-MIL-DNAzyme對H2O2的協(xié)同催化作用，基于CdSe/ZnS QDs和luminol構(gòu)建了檢測前列腺特異性抗原(PSA)的比率型ECL傳感器，檢出限為0.058 ng/mL，線性范圍為0.5～500 ng/mL。

2.3 其它類型的雙電位比率型ECL傳感器

圖4 QDs陰陽極發(fā)光機理圖[37]Fig.4 Schematic illustration of the ECL mechanism of GQDs[37]

2.4 可視化傳感分析

圖(橙色)和luminol(藍色)雙電位可視化比率型ECL生物傳感器原理圖[42]Fig.5 Schematic diagram of the visual dual potential ratiometric ECL biosensor between (orange) and luminol (blue)[42]

3 雙波長比率型生物傳感器

RET效率同時取決于供體的ECL效率和受體的量子產(chǎn)率，只有當供體的ECL效率足夠高時，才能產(chǎn)生足夠的激發(fā)能；當受體的量子產(chǎn)率足夠高時，才能將供體的激發(fā)能轉(zhuǎn)化為受體的光。最近，F(xiàn)an等[47]基于此原理利用金修飾的2,5-二((3(甲硫基)苯基)氨基)對苯二甲酸二甲酯(Au-g-C3N4/Au@TAT)，設(shè)計了一個雙波長比率型的ECL傳感器。g-C3N4的ECL發(fā)射波長為460 nm，而TAT的熒光發(fā)射波長為595 nm，二者可實現(xiàn)波長分辨。當目標物NF-κB p50存在時，Au@TAT-Ab可與目標物特異性結(jié)合，固定在電極表面；而Au@TAT紫外吸收峰位于475 nm，吸收帶較寬。因此，Au-g-C3N4與Au@TAT可發(fā)生RET，使Au@TAT在595 nm處產(chǎn)生一定強度的熒光。隨著目標物濃度的增大，460 nm處的ECL信號減弱，595 nm處的ECL信號增強。因此，可通過二者的比值實現(xiàn)目標物分析，原理見圖6。此傳感器檢出限為5.8 pmol/L，線性范圍為10 pmol/L～10 nmol/L，并成功應(yīng)用于人血清實際樣品檢測，加標回收率為95.4%～103.0%。

圖6 Au-g-C3N4-Au@TAT的雙波長比率型ECL生物傳感器原理圖[47]Fig.6 Schematic illustration of the wavelength resolution ratiometric ECL biosensor between Au-g-C3N4 and Au@TAT[47]

Liang小組[48]和Ye小組[49]也分別基于釕衍生物與Au-CNN之間的RET構(gòu)建了用于檢測亞砷酸鹽和cTnI的雙波長比率型傳感器。Huo等[50]和Zhu等[51]則分別基于Au NPs-luminol-層狀雙氫氧化物納米復(fù)合物(AuNP-luminol-LDH)和g-C3N4與金納米簇(Au NCs)之間的RET效應(yīng)，分別實現(xiàn)了對miRNA和cTnI的檢測。此外，Zhang等[52]以能產(chǎn)生三個不同波長的3,4,9,10-四羧酸二酐雙氫化物和苯胺自組裝的超分子納米材料(PTCDA-An)為發(fā)光材料，設(shè)計了一個檢測CEA的無標記型的免疫傳感器。

雙波長比率型的生物傳感器擴大了比率型ECL生物傳感器的應(yīng)用，但需要使用濾光片進行波長分辨，這使得檢測過程變得復(fù)雜化并且分辨率可能不高。

4 內(nèi)參比比率型ECL生物傳感器

內(nèi)參比比率型ECL傳感器可分為單電極內(nèi)參比型傳感器和雙電極內(nèi)參比型傳感器兩種類型。

4.1 單電極內(nèi)參比比率型的ECL生物傳感器

單電極內(nèi)參比比率型的ECL生物傳感器是指在一個電極上同時輸出兩個不同的信號，一個隨著目標物濃度的改變而改變作為工作信號，另一個固定不變以反映電極表面狀態(tài)作為參比信號。傳感器的參比信號的輸出模式一般可分為兩類：不同類型信號輸出模式，相同類型信號輸出模式。

圖內(nèi)參比比率型ECL生物傳感器原理圖[54]Fig.7 Schematic diagram of internal-referenced ratiometric ECL biosensor between and MB[54]

4.1.2 相同類型信號輸出模式石墨狀的碳氮量子點(g-CN QDs)在以K2S2O8和四丁基溴化銨為共反應(yīng)劑條件下，可同時在電位1.73 V和2.82 V產(chǎn)生ECL發(fā)射。當存在AA時，AA可有效地猝滅2.82 V處的ECL信號，而對1.73 V處的ECL信號無影響。據(jù)此，Wang小組[57]構(gòu)建了一個檢測AA的傳感器。Liu等[58]通過不同硫源對氮化硼量子點(BN QDs)進行硫摻雜，分別合成了以L-半胱氨酸為硫源的硫調(diào)節(jié)BN QDs(L-cysteine-S-BN QDs)和以硫脲為硫源的硫調(diào)節(jié)BN QDs(Thiourea-S-BN QDs)，二者可分別在535 nm和620 nm處產(chǎn)生最強ECL發(fā)射峰。Au NPs可與Thiourea-S-BN QDs發(fā)生表面等離子體耦合效應(yīng)實現(xiàn)信號擴增，而L-cysteine-S-BN QDs的信號強度無明顯變化，構(gòu)建了檢測BRAF基因的比率型傳感器，檢出限0.3 pmol/L，線性范圍為1 pmol/L～1.5 nmol/L。方法成功應(yīng)用于人血清實際樣品分析，加標回收率為93.33%～110.00%。

Ding課題組[17]通過在電極表面電聚合苯胺形成導電聚合物水凝膠，從而將luminol和CdTe QDs的共反應(yīng)劑K2S2O8包裹在內(nèi)，構(gòu)建了一個內(nèi)參比比率型的ECL生物傳感器。由于luminol包裹在水凝膠內(nèi)，固定在電極表面，可產(chǎn)生穩(wěn)定的ECL信號作為參比信號；而CdTe連接的二抗作為探針，其ECL信號隨著MCF-7細胞濃度的增加而增強，同時，由于K2S2O8固定在電極表面，電子轉(zhuǎn)移距離較近對CdTe的ECL信號也有一定的增強作用?？梢訡dTe和luminol的ECL信號比值實現(xiàn)對癌細胞的檢測，原理見圖8A。方法的檢出限為80 cells/mL，線性范圍為100～6 500 cells/mL，用于人血清樣品檢測時，其回收率為98.0%～102.8%。最近Cao等[59]將CsPbBr3納米晶(CPB)包裹在中空碳氮納米球(HCNS)內(nèi)形成CPB-HCNS納米復(fù)合物。對電極界面施加一定電壓時，CPB會產(chǎn)生一個陽極ECL信號，HCNS會產(chǎn)生一個陰極ECL信號。通過CPB與羅丹明6G(Rh6G)之間的RET實現(xiàn)對MCF-7細胞的檢測，如圖8B所示。檢出限為320 cells/mL，線性范圍為1.0×103～3.2×105cells/mL。

圖8 (A)CPH-CdTe內(nèi)參比比率型ECL生物傳感器原理圖[17]；(B)CPB-HCNS內(nèi)比比率型ECL生物傳感器原理圖Fig.8 (A)Schematic diagram of the internal-referanced ratiometric ECL biosensor based on CPH and CdTe QDs [17] ;(B) Schematic diagram of the internal-referanced ratiometric ECL biosensor based on CPB and HCNS[59]

4.2 雙電極內(nèi)參比率型的ECL生物傳感器

圖9 雙電極內(nèi)參比比率型ECL傳感器原理圖[62]Fig.9 Schematic diagram of the internal-referanced ratiometric ECL biosensor including two working electrodes[62]

5 總結(jié)與展望

比率型ECL生物傳感器不僅具有傳統(tǒng)的ECL生物傳感器的優(yōu)點，而且可以有效地避免儀器或環(huán)境的干擾，提高信噪比，使檢測結(jié)果更準確，已在金屬離子、DNA、蛋白質(zhì)及細胞的檢測方面顯示出越來越多的優(yōu)勢。未來的發(fā)展趨勢應(yīng)注重如下幾個方面：①設(shè)計新的比率體系，同時實現(xiàn)對兩種或兩種以上目標物的比率檢測；②尋找新的酶或共反應(yīng)劑促進劑催化共反應(yīng)劑，并對其機理進行研究，實現(xiàn)對共反應(yīng)劑濃度的調(diào)控；③篩選新的、能量轉(zhuǎn)移效率高的能量轉(zhuǎn)移對；④探索新的信號放大策略等。