金 迪 于布為

現(xiàn)代麻醉發(fā)展至今已有200年歷史，丙泊酚作為目前臨床上使用最廣泛的靜脈麻醉藥之一，通過激動GABAA受體產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用[1]。丙泊酚不僅廣泛用于各類外科手術(shù)的麻醉誘導和維持，也在有創(chuàng)、內(nèi)鏡檢查中發(fā)揮著重要作用。以其為代表的一些全身麻醉藥物在麻醉誘導時，緩慢增加麻醉藥血藥濃度，患者會出現(xiàn)反常興奮現(xiàn)象，表現(xiàn)為欣快或煩躁、胡言亂語、無意識動作增加，與麻醉藥的血藥濃度緩慢增加有關(guān)[2～5]。若給予較大的麻醉劑量快速注射，則這個過程會被掩蓋[6, 7]。因此，揭示反常興奮的大腦機制，有助于進一步理解全身麻醉藥物的作用機制。

基底神經(jīng)節(jié)在大腦調(diào)節(jié)各種生理活動中起到至關(guān)重要的作用，感覺皮質(zhì)-丘腦-基底神經(jīng)節(jié)-皮質(zhì)這一通路與獎懲、復雜運動的協(xié)調(diào)等高度相關(guān)[8～10]。與黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta， SNc)的多巴胺能神經(jīng)元不同，黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)作為基底節(jié)重要的運動相關(guān)輸出核團，主要分泌GABA這一類抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[11，12]。本研究使用了Gad2-ires-cre品系的轉(zhuǎn)基因小鼠，特點是在抑制性的GABA能神經(jīng)元中表達Cre重組酶，通過立體定位在黑質(zhì)網(wǎng)狀核注射腺相關(guān)病毒(pAAV-hSyn-flex-GCamp6f-WPRE-SV40pA)并植入光纖，待感染了神經(jīng)元并表達了鈣熒光指示蛋白GCamp6f后，使用光纖記錄系統(tǒng)，探討自由活動小鼠SNr的GABA能神經(jīng)元胞體活動及在腹腔注射丙泊酚或0.9%NaCl注射液后神經(jīng)元集群鈣信號的變化情況。

前期實驗發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過大于2h的手術(shù)麻醉后，小鼠在4周后再給予丙泊酚麻醉所需劑量遠大于未經(jīng)過手術(shù)的小鼠，因此模擬實驗條件，通過曠場實驗中小鼠的行為活動確定實驗所需的最適丙泊酚腹腔注射劑量。

材料與方法

1.材料：(1)實驗動物：C57BL/6小鼠8只(雌雄各4只)，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。Gad2-ires-cre轉(zhuǎn)基因小鼠8只，8周齡，由清華大學實驗動物中心繁育。(2)主要儀器：小動物麻醉機(美國Harvard Animal Anesthesia system公司)；高分辨率體視顯微鏡(德國Leica公司)；單軸顯微操作器/液壓(日本Narishige公司)；電動微型機械手(美國Sutter公司)；體式熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、全自動振動切片機(德國Leica公司)；光纖記錄系統(tǒng)(南京千奧星科)。(3)主要試劑：pAAV-hSyn-flex-GCamp6f-WPRE-SV40pA(泰爾圖；該病毒為AAV-腺相關(guān)病毒，hSyn-攜帶嚙齒類動物神經(jīng)元蛋白表達的啟動子，flex-條件性基因表達載體，在Cre重組酶的作用下激活目的基因的表達，GCamp6f-攜帶鈣指示蛋白的增強型綠色熒光蛋白)；4%多聚甲醛(PFA，美國Sigma公司)；異氟烷(深圳瑞沃德)；丙泊酚注射液(英國AstraZeneca UK Limited公司)。

2.曠場實驗評估丙泊酚麻醉效果：8只8周齡C57BL/6小鼠，隨機分為兩組，即35mg/kg注射劑量組和50mg/kg注射劑量組。為模擬光纖手術(shù)需接受的麻醉暴露條件，將小鼠放入麻醉誘導箱(尺寸：20cm×20cm×15cm)中，給予1.5%異氟烷混合60%氧氣，持續(xù)2h，氣體流量為0.6L/h，實驗過程中使用動物保溫毯維持體溫，4周后進行曠場實驗。將濃度為10mg/ml丙泊酚注射液用5%葡萄糖溶液稀釋成5mg/ml，稱量小鼠的體質(zhì)量，計算注射劑量進行腹腔注射。注射完成后放入搭建好的實驗平臺開始視頻記錄(圖1A)，每只小鼠記錄10min。分析小鼠10min內(nèi)的活動狀態(tài)(如翻正反射是否消失)及移動距離和速度情況，評估丙泊酚麻醉效果。

3.病毒注射：使用3%異氟烷將Gad2-ires-cre轉(zhuǎn)基因小鼠誘導麻醉，固定于立體定位儀上，降低異氟烷濃度為1.0%～1.5%，氧氣流量0.6L/h，手術(shù)全程使用動物保溫毯維持溫度。將小鼠覆蓋頭頂?shù)拿l(fā)剃除，剪開頭皮充分暴露顱骨，并將附著在頭骨上的軟組織刮除，保證頭骨表面無毛發(fā)、黏膜、血液，用棉簽擦干表面。根據(jù)骨縫定位Bregma點和Lambda點，調(diào)整小鼠頭部前后、左右處于水平位置。根據(jù)小鼠腦區(qū)立體定位坐標系圖譜以Bregma點為原點定位病毒注射位點[圖1B；軸向距離AP:-3.20；水平距離ML:±1.5；深度DV:4.60；單位為毫米(mm)]，用電鉆打磨至暴露硬腦膜。將拉制好的玻璃電極充滿礦物油，安裝在顯微操作器上，緩慢吸取適量病毒后固定在立體定位儀上，定位至注射位點上方。緩慢下降，以電極尖端接觸硬腦膜平面為零面，下降電極至深度4600μm。以10nl/min的速度緩慢注射病毒，共計100ml，等待10min。病毒注射時，觀察電極液平面緩慢下降，證實病毒順利注入。

4.光纖陶瓷插芯植入:實驗使用直徑200μm的光纖陶瓷插芯(數(shù)值孔徑為0.37)，手術(shù)前先進行透光率測試。黑暗環(huán)境下設(shè)置激光功率測量儀檢測波長為480nm，根據(jù)測量儀示數(shù)調(diào)整光纖記錄儀器輸出功率至40μW。使用連接器將光纖陶瓷插芯安裝在光纖跳線，保證二者同軸后記錄測量儀示數(shù)，在示數(shù)達到32μW以上即透光率達到80%光纖陶瓷插芯才可用于實驗。使用夾持器固定好光纖陶瓷插芯，緩慢植入至硬腦膜下4.55mm(圖1B)，使用氰基丙烯酸膠涂抹在周圍顱骨及皮膚和頭骨相接處，待膠水干燥后，使用牙科水泥加固。術(shù)后皮下注射氟美林0.3ml，連續(xù)3天，待小鼠清醒后放回原籠飼養(yǎng)。

5.光纖鈣信號記錄:在避光環(huán)境下，打開光纖記錄系統(tǒng)，等待基線穩(wěn)定。實驗前稱量小鼠體質(zhì)量計算腹腔注射劑量，將小鼠放入在透明實驗箱中適應(yīng)10min后，記錄原始基線幅值后進行光纖記錄，同時視頻記錄小鼠行為。清醒狀態(tài)下記錄小鼠5min后，腹腔注射0.9%NaCl注射液/丙泊酚溶液，觀察小鼠行為變化，標記出現(xiàn)翻正反射消失(loss of righting reflex, LORR)和翻正反射恢復時間，待恢復后再記錄5min，其中，翻正反射消失的定義標準為：調(diào)整小鼠姿態(tài)為仰臥位后在10s內(nèi)無法恢復立位。

6.心臟灌流和腦組織切片:記錄完成后，用0.3%戊巴比妥溶液，按體質(zhì)量以0.2ml/10g計算劑量進行腹腔注射，5～10min左右通過掐尾觀察有無體動反應(yīng)判斷麻醉深度。在劍突下剪一適當切口，沿胸廓兩側(cè)打開胸腔，暴露出心臟。灌流管路預(yù)先充滿PBS溶液，針尖插入左心室向主動脈方向進針約3～4mm，固定針尖，剪開右心耳，PBS灌流至無血液流出后，更換灌洗液為4%PFA，固定腦組織。灌流結(jié)束后，剝除顱骨取腦，浸入4%PFA再固定24h后，預(yù)處理后 2%瓊脂糖包埋，振蕩切片機做冠狀位組織切片，厚度為100μm。通過與小鼠腦圖譜匹配，確定SNr的位置，使用1000×DAPI染料浸沒腦片染色3min，然后搖床PBS沖洗3次，每次5min，待干后使用抗熒光衰減劑封片，熒光顯微鏡下觀察、拍片。

結(jié) 果

1.腹腔注射丙泊酚劑量確定：視頻分析發(fā)現(xiàn)，腹腔注射丙泊酚的劑量不同，兩組小鼠在10min的移動距離、中心點平均速度及丙泊酚產(chǎn)生的鎮(zhèn)靜效果方面的表現(xiàn)差異很大(表1)。35mg/kg組小鼠在腹腔注射丙泊酚約30s會出現(xiàn)行為活躍性增加的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為運動速度增加、左搖右晃步態(tài)且伴有頻繁的前/后肢的搔抓。該組小鼠都未出現(xiàn)翻正反射消失，并在6～7min左右步態(tài)恢復。50mg/kg組小鼠同樣在30s左右出現(xiàn)了活躍性增加的現(xiàn)象，但與35mg/kg組小組比較，小鼠的移動距離和速度降低(P<0.05)，在4min左右出現(xiàn)了翻正反射消失，持續(xù)約90s。

圖1 實驗裝置A.曠場實驗；B.病毒注射及光纖植入的模式圖；C.光纖記錄系統(tǒng)模式圖

2.光纖鈣信號記錄:對自由活動小鼠的黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的GABA能神經(jīng)元進行光纖記錄，發(fā)現(xiàn)在清醒狀態(tài)下神經(jīng)元呈非同步、運動相關(guān)發(fā)放。在行動時，鈣活動水平低，而在靜止不動時神經(jīng)元發(fā)放幅值大，而在麻醉狀態(tài)下神經(jīng)元則以一定節(jié)律同步發(fā)放，且幅值減弱(圖2)。

腹腔注射0.9%NaCl注射液并沒有引起SNr神經(jīng)元鈣活動的改變，而給予丙泊酚50mg/kg劑量注射后，GABA能神經(jīng)元的活動隨小鼠的狀態(tài)發(fā)生了明顯的改變。腹腔注射完成1min后，小鼠出現(xiàn)反常興奮，伴隨每一次搔抓前肢，鈣信號幅值增大。隨著鎮(zhèn)靜水平的加深，小鼠的活動減弱至翻正反射消失，待蘇醒后，前期小鼠的活動少，記錄到的神經(jīng)元鈣信號增加(圖3)。

表1 不同劑量丙泊酚麻醉誘導表現(xiàn)

圖2 自由活動小鼠的光纖鈣信號記錄結(jié)果A.清醒狀態(tài)下；B.麻醉狀態(tài)下

圖3 單次腹腔注射丙泊酚麻醉誘導/生理鹽水的光纖鈣信號記錄A.腹腔注射0.9%NaCl注射液;B.腹腔注射丙泊酚，紅色矩形框中為翻正反射消失到恢復一段時間，即為“意識喪失時期”

3.病毒表達及光纖軌跡:從腦組織冠狀切片看，匹配小鼠腦圖，GCamp6f在SNr區(qū)域穩(wěn)定表達，且光纖記錄位點正處于神經(jīng)元集群內(nèi)(圖4)。

圖4 SNr神經(jīng)元的GCamP6f表達熒光顯微鏡下所攝冠狀腦片，類橢圓形區(qū)域為SNr，矩形區(qū)域為光纖植入軌跡，比例尺為500μm。綠色熒光為GCamP6f表達，藍色為DAPI染色顯示神經(jīng)元分布

討 論

本研究使用Gad2-ires-cre品系的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過使用Cre重組酶依賴的GCaMP6f病毒特異標記黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的GABA能神經(jīng)元，然后利用光纖鈣信號記錄系統(tǒng)，監(jiān)測SNr核團抑制性神經(jīng)元的鈣活動，探索丙泊酚麻醉誘導出現(xiàn)的反常興奮期、翻正反射消失狀態(tài)下SNr的活動情況。

臨床麻醉過程中，以丙泊酚、依托咪酯和七氟醚為代表的全身麻醉藥物在患者的麻醉誘導階段會出現(xiàn)與鎮(zhèn)靜目標相悖的行為狀態(tài)，其表現(xiàn)出的無意識的肢體動作增加與基底神經(jīng)節(jié)可能相關(guān)[13]?；咨窠?jīng)節(jié)中黑質(zhì)核團可根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)的不同，分為黑質(zhì)致密部和黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。黑質(zhì)致密部神經(jīng)元分泌多巴胺，與獎賞的神經(jīng)調(diào)節(jié)有關(guān)，而SNr神經(jīng)元主要合成GABA這一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，投射到丘腦參與復雜運動的調(diào)控[14,15]。全身麻醉藥物的分子機制研究結(jié)果表明，幾乎所有的全身麻醉藥物都可通過激動GABAA受體抑制神經(jīng)元，并以丙泊酚為代表。

本研究采用立體定位注射的方法向黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)注射Cre重組酶依賴病毒，實現(xiàn)在SNr核團的GABA能神經(jīng)元表達GCaMP6f。由腦組織冠狀切片結(jié)果觀察，筆者成功標記了SNr核團的神經(jīng)元，與文獻中報道的GABA神經(jīng)元分布情況相似[16]。光纖記錄系統(tǒng)對于研究自由活動的動物行為狀態(tài)有其獨特的優(yōu)勢[17]。相比較而言，電生理記錄因為其復雜的記錄系統(tǒng)和操作，其更適用于固定小鼠，且雖然其能夠采集單個神經(jīng)元的電信號活動，卻沒有細胞特異性，而光纖鈣信號記錄則可以通過轉(zhuǎn)基因小鼠的選擇和病毒注射以實現(xiàn)采集特定的神經(jīng)元信號，這對于研究深部腦區(qū)的神經(jīng)元集群活動在清醒-麻醉轉(zhuǎn)換有著廣闊的前景[18，19]。

在清醒狀態(tài)下，黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元鈣活動在自由活動的小鼠中呈現(xiàn)與運動相關(guān)發(fā)放。小鼠移動時，鈣基線穩(wěn)定，若靜止不動、前后肢搔抓等行為，則鈣活動增強這與之前的研究結(jié)果一致，同時再次驗證記錄的有效性[20]。對小鼠進行丙泊酚麻醉誘導，鈣活動水平會隨著“反常興奮”期的出現(xiàn)而增強，而當翻正反射消失后，鈣活動減弱。腹腔注射丙泊酚引起的麻醉時效短，與丙泊酚藥物代謝快相關(guān)，也可能與小鼠經(jīng)過多次麻醉后出現(xiàn)了耐受有關(guān)。在麻醉恢復后，小鼠會出現(xiàn)嗜睡現(xiàn)象，SNr的神經(jīng)元鈣活動也相應(yīng)增強。

綜上所述，本研究通過對轉(zhuǎn)基因小鼠進行病毒注射，特異性標記黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的GABA能神經(jīng)元表達鈣指示蛋白，成功利用光纖鈣成像技術(shù)記錄了丙泊酚全麻誘導后神經(jīng)元活動。目前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),SNr的GABA神經(jīng)元在清醒-麻醉-蘇醒過程，其鈣活動水平會出現(xiàn)先增強后減弱再增加的現(xiàn)象。在反常興奮期中GABA能神經(jīng)元的活動增強可能驅(qū)動小鼠從反常興奮期向麻醉狀態(tài)過渡。