閆大勇 蔡曉清 郭樂樂 鐘克濤 張 瑞

口腔鱗癌是世界上最常見的口腔惡性腫瘤，每年有超過27.5萬(wàn)新發(fā)病例，將近12.5萬(wàn)患者因此死亡。因其復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移快、預(yù)后差等特點(diǎn)導(dǎo)致口腔鱗癌的5年生存率約為50%[1,2]。因此，研究口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，為口腔鱗癌診治提供新的靶點(diǎn)，從而提高治療效果，具有重要意義。

TPM1(tropomyosin-1)是原肌球蛋白家族成員，在肌肉細(xì)胞中通過鈣離子調(diào)節(jié)肌肉收縮，而在非肌肉細(xì)胞中具有復(fù)雜的功能性[3,4]。有研究表明原肌球蛋白的突變與心臟和骨骼肌疾病直接相關(guān)，而原肌球蛋白表達(dá)水平的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5,6]。Shin等[7]首先報(bào)道了在乳腺癌中TPM1的表達(dá)下調(diào)并抑制腫瘤的進(jìn)展，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)TPM1在腎癌細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào),并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制其侵襲[8]。但目前TPM1是否對(duì)口腔鱗癌的細(xì)胞生物學(xué)行為有影響以及影響機(jī)制尚不明確。

本研究通過患者的組織樣本分析TPM1在口腔鱗癌中的表達(dá)水平，通過構(gòu)建TPM1干擾質(zhì)粒，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖、遷移和侵襲功能以及MMPs蛋白表達(dá)水平的變化，初步探討口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制。

資料與方法

1.組織標(biāo)本采集：收集鄭州市中心醫(yī)院2018年9月～2019年5月口腔鱗癌手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本30例及癌旁組織標(biāo)本7例。選擇要求如下：①術(shù)前及術(shù)后病理證實(shí)為口腔鱗癌；②患者術(shù)前未行放療、化療及其他治療；③術(shù)后病理取材部位包括表面區(qū)、中心區(qū)、深層浸潤(rùn)區(qū)、癌旁組織；④本研究納入30例研究對(duì)象，其中，男性17例，女性13例，患者平均年齡57.3歲(27～71歲)，T1期12例，T2期13例；T3期5例。所有程序經(jīng)鄭州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審查批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

2.細(xì)胞株與主要試劑：人口腔鱗癌細(xì)胞株CLA27和HSC3(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)，優(yōu)質(zhì)小牛血清(美國(guó)Invitrogen公司)，GAPDH抗體，MMPs抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。TPM1敲減以及過表達(dá)及其空白重組質(zhì)粒(美國(guó)GeneCopoeia公司)，Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將適量細(xì)胞種至6孔板中，至細(xì)胞融合達(dá)到60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在150μl RPMI1640中分別加入5μl Lipofectamine TM 2000和4μg質(zhì)粒，室溫靜置5min，輕輕混勻，孵育20min。棄去原6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，加入RPMI1640和混合物共1ml，4～6h之后再更換成含有血清的培養(yǎng)基。

4.RT-PCR檢測(cè)樣本中TPM1的表達(dá)：Trizol法提取組織/細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶按說(shuō)明書將其轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件為 95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，使用2-ΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

5.細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后的細(xì)胞用胰酶消化并計(jì)數(shù)，按每孔1500～2000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每組6個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 0、24、48、72h后使用CCK-8測(cè)量。測(cè)量時(shí)每孔加入10μl CCK-8試劑和100μl培養(yǎng)基混合液，并設(shè)立空白對(duì)照孔，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，酶標(biāo)儀檢測(cè) 450nm波長(zhǎng)處的吸光度值，注意檢測(cè)時(shí)要除去氣泡。

6.細(xì)胞遷移：在6孔板中加入約106個(gè)細(xì)胞使過夜后細(xì)胞融合率達(dá)到 100%。第2天用20μl高壓滅菌槍頭比著直尺，垂直于標(biāo)記的橫線劃痕。PBS洗去除劃線時(shí)脫落的細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基 1毫升/孔。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按 0、6、12、24h取樣，在10倍鏡頭下拍照。使用Image J軟件計(jì)算面積，通過面積和高度計(jì)算平均距離。

7.細(xì)胞侵襲：將培養(yǎng)基與Matrigel基質(zhì)膠以1∶10的比例混合后，在每個(gè)小室上室加入90ml，孵育4～6h，待其凝固后，將轉(zhuǎn)染48h的細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，在上室加入200μl細(xì)胞懸液(含1×105個(gè)細(xì)胞)，下室加入800μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后取出Transwell小室，將上室中殘留細(xì)胞擦去，下室采用結(jié)晶紫染色20min，PBS 沖洗3～4次后，對(duì)膜下方細(xì)胞采用觀察并計(jì)數(shù)。每組重復(fù)3次。

8.Western blot法檢測(cè)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后提取蛋白，檢測(cè)蛋白濃度。每孔上樣20μg，使用10%SDS-PAGE膠電泳分離，之后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下5%脫脂牛奶封閉2～3h，TBST洗3次(每次10min)，隨后一抗4℃孵育，搖床過夜，次日TBST洗膜，二抗室溫孵育1～2h，洗膜3次之后顯影，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

結(jié) 果

1.TPM1的表達(dá)水平：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，TPM1在人口腔鱗癌組織中相對(duì)表達(dá)水平顯著高于人正?？谇唤M織中的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 TPM1在口腔鱗癌組織和正常組織中表達(dá)水平*P<0.05

2.各組細(xì)胞系轉(zhuǎn)染TPM1后相對(duì)表達(dá)量比較：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，與空載組比較，過表達(dá)組TPM1表達(dá)水平顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；敲減組TPM1表達(dá)水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 過表達(dá)以及敲減TPM1后TPM1表達(dá)水平變化A.CLA27細(xì)胞；B.HSC3細(xì)胞；與空載組比較，*P<0.05

3.TPM1表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞增殖的影響：TPM1過表達(dá)后，細(xì)胞的增殖速度顯著升高；敲減TPM1后，細(xì)胞的增殖速度顯著降低(P<0.05,圖3)。

圖3 過表達(dá)以及敲減TPM1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖活性的影響A.過表達(dá)TPM1促進(jìn)細(xì)胞增殖；B.敲減TPM1抑制細(xì)胞增殖；與空載組比較，*P<0.05

4.TPM1表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞遷移的影響：劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)TPM1后，細(xì)胞的遷移速度顯著升高；敲減TPM1后，細(xì)胞的遷移速度顯著降低(P<0.05,圖4)。

圖4 過表達(dá)以及敲減TPM1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞遷移活性的影響(×400)A.過表達(dá)TPM1促進(jìn)細(xì)胞遷移；B.敲減TPM1抑制細(xì)胞遷移;與空載組比較，*P<0.05

5.TPM1表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞侵襲的影響：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá) TPM1后細(xì)胞的侵襲能力顯著升高；敲減TPM1后細(xì)胞的遷侵襲能力顯著降低(P<0.05,圖5)。

圖5 過表達(dá)以及敲減TPM1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞侵襲活性的影響(×400)A.過表達(dá)TPM1促進(jìn)細(xì)胞侵襲；B.敲減TPM1抑制細(xì)胞侵襲;與空載組比較，*P<0.05

6.干擾TPM1表達(dá)對(duì)MMPs表達(dá)水平的影響：通過前期細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)干擾 TPM1的表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞侵襲、遷移的能力。進(jìn)一步通過Western blot法檢測(cè)MMPs表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)TPM1后MMP9的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，MMP2和MMP7的表達(dá)水平不受影響；敲減TPM1后MMP9的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，然而MMP2和MMP7的表達(dá)水平不受影響(圖6)。

圖6 過表達(dá)以及敲減TPM1對(duì)MMPs蛋白表達(dá)的影響

討 論

口腔鱗癌是頭頸部鱗癌最常見的類型，大約占口腔惡性腫瘤的90%。盡管口腔鱗癌的發(fā)生率和病死率最近逐漸降低，但是其5年生存率仍然低于50%[9～11]。普遍認(rèn)為，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致口腔鱗癌患者死亡的主要原因[12]。因此，闡明調(diào)節(jié)口腔鱗癌轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制對(duì)于口腔鱗癌的治療至關(guān)重要。但是，口腔鱗癌轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制至今尚不清楚。本研究通過RT-PCR檢測(cè)口腔鱗癌組織和癌旁組織標(biāo)本TPM1的表達(dá)情況，選取CLA27和HSC3細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象，構(gòu)建TPM1干擾質(zhì)粒。采用RT-PCR檢測(cè)TPM1轉(zhuǎn)染后表達(dá)效果，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞0、24、48和72h增殖情況，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移，Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，Western blot法檢測(cè)MMP家族蛋白表達(dá)情況，探究了TPM1在口腔鱗癌組織中的表達(dá)情況及對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞惡性表型的影響，這將有助于理解口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，為口腔鱗癌的診斷治療提供新的靶點(diǎn)。

TPMs是一類原肌球蛋白，有大約40種亞型，它們?cè)趹?yīng)激纖維調(diào)節(jié)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架修飾中起關(guān)鍵作用[13]。近年來(lái)，大量研究表明TPMs與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲密切相關(guān)[14, 15]。在所有原肌球蛋白家族成員中，TPM1最常參與癌癥的發(fā)展[16]。研究表明，TPM1作為重要的抗腫瘤基因在乳腺癌，結(jié)腸癌和膀胱癌在內(nèi)的各種實(shí)體瘤中的表達(dá)均被下調(diào)[17]。

最近的研究證實(shí)了TPM1在乳腺癌細(xì)胞中的抗腫瘤作用。Ras-ERK信號(hào)通路通過抑制TPM的表達(dá)來(lái)抑制TGF-β誘導(dǎo)的應(yīng)激纖維變化，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更具侵襲性。此外，TPM1過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制腎癌細(xì)胞的侵襲[8]。盡管許多研究表明TPM1在多種腫瘤類型中均具有抑癌作用，但其在口腔鱗癌中的作用及其潛在機(jī)制仍然未知。

本研究探索了TPM1對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)TPM1在口腔鱗癌組織中高表達(dá)，提示TPM1可能是口腔鱗癌的不良預(yù)后指標(biāo)。筆者分別在CLA27和HSC3細(xì)胞系過表達(dá)和敲低TPM1，結(jié)果表明，TPM1的過表達(dá)促進(jìn)口腔鱗癌中的細(xì)胞增殖，敲減抑制了口腔鱗癌細(xì)胞增殖能力，說(shuō)明干擾質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染了CLA27和HSC3細(xì)胞，并且調(diào)節(jié)了細(xì)胞中TPM1的表達(dá)。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)TPM1之后細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)，敲減之后遷移能力顯著降低，說(shuō)明TPM1表達(dá)對(duì)維持口腔鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有重要作用。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá) TPM1顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的侵襲能力，說(shuō)明TPM1表達(dá)對(duì)維持口腔鱗癌細(xì)胞的遷移有重要作用。研究表明MMPs在調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲、遷移和血管生成中發(fā)揮重要作用[18]。本研究通過Western blot法檢測(cè)表明TPM1的過表達(dá)顯著上調(diào)MMP9，而對(duì)MMP2、MMP7的表達(dá)沒有影響，說(shuō)明TPM1可能通過MMP9調(diào)節(jié)口腔鱗癌細(xì)胞的惡性表型。MMP9主要來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的分泌，其在腫瘤組織內(nèi)的高表達(dá)可能在口腔鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。該機(jī)制的發(fā)現(xiàn)有助于對(duì)口腔鱗癌侵襲和遷移的評(píng)價(jià)提供有意義的參數(shù)。但本研究仍然存在一些不足之處，TPM1調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制有待于進(jìn)一步探索，后續(xù)可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，TPM1可能通過MMP9調(diào)節(jié)口腔鱗狀癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。TPM1可能作為新型腫瘤標(biāo)志物為口腔鱗狀細(xì)胞癌的診斷治療提供新的靶點(diǎn)。