季佳宇 王啟儼 方 勝 田毅夫 劉福生 米蕊芳

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤之一，其中約50%為惡性程度極高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。由于其具有廣泛浸潤性、血-腦脊液屏障的保護及局部和系統(tǒng)性的免疫抑制，在經(jīng)過手術(shù)、放療和化療等綜合治療后其中位生存期僅為15個月[1，2]。溶瘤病毒療法(oncolytic virus therapy)是一種很有前途的癌癥基因治療療法，溶瘤病毒可以在惡性細(xì)胞中選擇性復(fù)制，導(dǎo)致癌細(xì)胞裂解，同時釋放腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)、病原相關(guān)分子模式(PAMPS)和危險相關(guān)分子模式(DAMPS)刺激腫瘤細(xì)胞的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[3,4]。

溶瘤腺病毒是最常見的溶瘤病毒之一，通過對相關(guān)基因的修飾或改造，溶瘤腺病毒可以在腫瘤細(xì)胞中進行特異性復(fù)制和裂解，引起炎性反應(yīng)促進免疫應(yīng)答[5]。在已經(jīng)進行的臨床試驗中，溶瘤腺病毒顯示出令人滿意的安全性[6]。腺病毒具有高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和遺傳穩(wěn)定性，其結(jié)構(gòu)和基因功能已經(jīng)有了比較完善的描述，對其進行修飾改造相對簡單易行[7，8]。然而，由于實體腫瘤的結(jié)構(gòu)復(fù)雜及腫瘤微環(huán)境的存在，溶瘤病毒難以完全發(fā)揮作用。

人內(nèi)皮抑素(endostatin, Endo)和血管生成抑素(angiostatin, Angio)作為一種融合的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)分子Endo-Angio能夠有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生。Endo-Angio 融合蛋白能夠抑制膠質(zhì)瘤等腫瘤中新生血管的生長，破壞腫瘤微環(huán)境，且能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并極少產(chǎn)生耐藥性[9]。有研究顯示溶瘤病毒中插入人內(nèi)皮抑素和血管生成抑素融合基因可以表達(dá)Endo-Angio 融合蛋白，能夠顯著抑制人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)的增殖[10]。

人白介素15(IL-15)是一種免疫調(diào)節(jié)分子，在淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫應(yīng)答過程中，IL-15可以促進T細(xì)胞增殖分化、B細(xì)胞相關(guān)抗體的分泌。有研究顯示，在溶瘤性水皰性口炎病毒(VSV)中插入高分泌型hIL-15感染腫瘤細(xì)胞，被感染的CT-26腫瘤細(xì)胞局部表達(dá)IL-15 明顯增強，導(dǎo)致T細(xì)胞的免疫反應(yīng)增強[11]。本研究通過構(gòu)建攜帶Endo-Angio、IL-15雙基因的溶瘤腺病毒，研究其在體外對膠質(zhì)瘤細(xì)胞是否具有明顯的殺傷作用和特異性。

材料與方法

1.材料：GL261細(xì)胞和永生化的小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251從北京細(xì)胞庫獲得。DMEM培養(yǎng)基、PBS磷酸鹽緩沖溶液、胰蛋白酶和雙抗(100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)購自美國Gibco公司, 胎牛血清購自杭州四季青公司,CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。溶瘤病毒載體由筆者實驗室保存。

2.溶瘤腺病毒載體及插入EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒的構(gòu)建：(1)溶瘤腺病毒載體(oAD)：去除腺病毒穿梭載體pXC1，在E1A區(qū)域添加survivin啟動子，刪除E1B區(qū)域的19kDa區(qū)域。(2)插入EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15)：PCR的方法將EA-IL-15雙基因插入腺病毒穿梭載體pXC1，Endo-Angio基因和IL-15基因中間通過核糖體進入位點(IRES)連接，將穿梭質(zhì)粒pXC1-EA-IL-15及輔助質(zhì)粒pBHG loxΔE1, 3 Cre質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK393細(xì)胞，得到溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：GL261小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞和BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在常氧條件下用含有10%胎牛血清的DMEM、1%雙抗的培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞用含有0.05%的胰蛋白酶液進行消化和傳代。

4.細(xì)胞加藥實驗：取對數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h，按照不同MOI值加入病毒感染，培養(yǎng)72h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并定量分析細(xì)胞的相對活性。

5.CCK-8細(xì)胞毒性實驗：病毒感染72h，取出96孔板，每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度。

結(jié) 果

1.構(gòu)建溶瘤腺病毒載體(oAD)：去除腺病毒穿梭載體pXC1，在E1A區(qū)域添加survivin啟動子，使其對腫瘤細(xì)胞具有特異性感染；刪除E1B區(qū)域的19kDa區(qū)域，使得病毒獲得誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，并增加腺病毒的傳播能力，構(gòu)建成溶瘤腺病毒載體(oAD)。體外病毒包裝得到空載溶瘤腺病毒oAD。

圖1 倒置顯微鏡下觀察空載溶瘤腺病毒(oAD)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261形態(tài)的影響(×100)A.對照組；B.MOI=10 oAD處理組；C.MOI=100 oAD處理組

2.溶瘤腺病毒oAD對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外殺傷作用及特異性研究：溶瘤腺病毒oAD感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261，72h后倒置顯微鏡下觀察，可見對照組細(xì)胞貼壁生長，排列規(guī)則，細(xì)胞密度大。實驗組中隨著MOI值的增高，細(xì)胞密度減少，細(xì)胞形態(tài)皺縮，詳見圖1。說明oAD對GL261細(xì)胞有一定的殺傷作用。將oAD同時作用于GL261細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞BV2(非腫瘤細(xì)胞)。感染72h后測定細(xì)胞相對活性，可以看到與對照組(PBS)比較，oAD對GL261具有明顯的殺傷作用(P<0.05)，并且在不同MOI值病毒的作用下，oAD對GL261的殺傷作用明顯高于對BV2，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 空載溶瘤腺病毒(oAD)特異性及有效性分析與對照組比較，*P<0.05；GL261與BV2比較，#P<0.05

3.構(gòu)建插入EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15)：為了增強溶瘤病毒對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，筆者將Endo-Angio及IL-15基因定向克隆構(gòu)建到溶瘤腺病毒oAD的腺病毒穿梭載體pXC1中，構(gòu)建成EA-IL-15雙基因腺病毒載體pXC1-EA-IL-15。PCR的方法檢測所插入的基因，可見挑取的8個克隆株中有7個攜帶有EA-IL-15基因，詳見圖3。Endo-Angio基因和IL-15基因中間通過核糖體進入位點(IRES)連接，可同時表達(dá)，詳見圖4。筆者進一步將穿梭質(zhì)粒pXC1- EA-IL-15及輔助質(zhì)粒pBHG loxΔE1, 3Cre質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK393細(xì)胞，得到溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。

圖3 插入EA-IL-15雙基因轉(zhuǎn)化子PCR鑒定分析1.空白對照組；2.陰性對照；3.陽性對照；4.250bp DNA Ladder(自上至下：5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp)；5～12.1～8號克隆轉(zhuǎn)化子

圖4 插入EA-IL-15雙基因的腺病毒穿梭載體pXC1結(jié)構(gòu)

4.插入EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外殺傷作用及特異性研究：統(tǒng)一兩病毒效價，將oAD-EA-IL-15及oAD溶瘤病毒分別感染GL261細(xì)胞，感染72h后測定細(xì)胞的相對活性，繪制劑量反應(yīng)曲線?？梢婋S著溶瘤病毒濃度的增加，GL261細(xì)胞相對活性不斷下降。說明兩種溶瘤病毒對GL261細(xì)胞均有殺傷作用(P<0.01)，其中oAD-EA-IL-15對GL261細(xì)胞的殺傷作用明顯優(yōu)于oAD(P<0.01)，詳見圖5。oAD-EA-IL-15對GL261細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)值為0.58×107±1.30×105PFU/ml，低于oAD的IC50值1.13×107±1.98×105PFU/ml(P<0.01)，說明oAD-EA-IL-15對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用強于oAD。

圖5 雙基因溶瘤腺病毒對小鼠膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞作用分析與對照組比較，*P<0.01；#P<0.01

將oAD-EA-IL-15及oAD溶瘤病毒分別感染小膠質(zhì)細(xì)胞(非腫瘤細(xì)胞)BV2。72h后在不同劑量下測定細(xì)胞的相對活性，詳見圖6?？梢钥吹給AD-EA-IL-15(P<0.05)對其活性的影響低于oAD(P<0.01)。在病毒效價同為108PFU/ml時，oAD-EA-IL-15感染下的BV2細(xì)胞相對活性高于 oAD (P<0.01)，說明oAD-EA-IL-15病毒的特異性優(yōu)于oAD病毒。

圖6 雙基因溶瘤腺病毒特異性分析oAD及oAD-EA-IL-15病毒對BV2細(xì)胞的作用。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；#P<0.01

討 論

筆者在構(gòu)建溶瘤腺病毒載體的時候選擇在E1A區(qū)添加特異性啟動子，特異性的腫瘤組織啟動子可以控制病毒增殖必需基因的表達(dá)，從而獲得病毒對腫瘤細(xì)胞的選擇性復(fù)制[12]。腫瘤特異性啟動子包括survivin啟動子、環(huán)氧化酶(COX-2) 啟動子、hTERT啟動子等。筆者選用的survivin啟動子在80%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞中有豐富的表達(dá)，且其陽性腫瘤樣本的比例與膠質(zhì)瘤的組織學(xué)分級存在明顯的相關(guān)性[13]。此外，筆者還刪除了E1B-19k區(qū)域，該區(qū)域所編碼產(chǎn)物功能類似于抗凋亡因子Bcl-2可以抑制Bax和TNF發(fā)揮抗凋亡作用，19k的缺失能夠協(xié)同溶瘤腺病毒在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制，增強病毒傳播能力[14]。在溶瘤腺病毒載體的基礎(chǔ)上筆者補充了結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因Endo-Angio和免疫調(diào)節(jié)基因IL-15，希望病毒本身的溶瘤作用和外源基因的治療作用協(xié)同，增強病毒的擴散及對腫瘤的殺傷能力。

在體外實驗中可見，oAD-EA-IL-15和oAD對于腫瘤細(xì)胞均具有特異性的殺傷效果。對于腫瘤細(xì)胞，oAD-EA-IL-15的殺傷效果更好，對于非腫瘤細(xì)胞，oAD-EA-IL-15有更好的特異性，在溶瘤病毒的體內(nèi)治療過程中，更好的特異性就意味著更好的安全性，加強患者的預(yù)后。

在面對體內(nèi)的實體腫瘤中，腫瘤中存在不支持溶瘤腺病毒的復(fù)制的缺氧區(qū)域、相關(guān)成纖維細(xì)胞的積累、致密的細(xì)胞外基質(zhì)和新生血管的形成都可以阻礙溶瘤腺病毒的傳播[8]。對此，通過構(gòu)建攜帶Endo-Angio基因的溶瘤腺病毒，來達(dá)到抑制新生血管形成的作用，一方面在結(jié)構(gòu)上減少實體腫瘤的復(fù)雜程度；另一方面減少腫瘤組織的血供，導(dǎo)致未感染的腫瘤細(xì)胞凋亡(旁觀者殺傷效應(yīng))，從而抑制腫瘤的生長[15]。腫瘤周圍還有腫瘤微環(huán)境，其中往往含有對溶瘤病毒有殺傷作用的自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞，阻礙溶瘤病毒擴散的腫瘤基質(zhì)等非腫瘤細(xì)胞、可以抵消溶瘤腺病毒免疫刺激優(yōu)勢的Tregs、MDSCs等抑制性免疫細(xì)胞[16]。IL-15是NK細(xì)胞、自然殺傷類細(xì)胞以及CD44高表達(dá)CD8+T 細(xì)胞激活的必需因子，通過活化NK細(xì)胞可以增強抗腫瘤活性，且不會增加Tregs細(xì)胞的數(shù)量和活性[17，18]。IL-15還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的組織間隙來促進溶瘤病毒的擴散，并且可以增加血管抑制性藥物的抗血管作用[19]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了溶瘤腺病毒載體(oAD)及oAD-EA-IL-15溶瘤病毒，并且體外實驗的結(jié)果表明，oAD-EA-IL-15溶瘤病毒對膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261有明顯的殺傷作用，同時具有一定的特異性。本研究為oAD-EA-IL-15溶瘤病毒對膠質(zhì)瘤及其他實體腫瘤的治療研究提供了良好的實驗依據(jù)。