鐘 欣 黃紫洋 趙夢陽

(福建師范大學化學與材料學院，福州 350007)

生物陶瓷材料所具有的機械性能、結構性能、物理性能和化學性能的多樣性，使其能夠應用于不同的領域[1-3]。例如，生物陶瓷材料可通過與身體組織結合進而修復或替換受損組織，因而在老齡化人口的疾病治療方面日益受到重視[4]。為了提高生物醫(yī)用材料的性能，研究開發(fā)新的生物醫(yī)用材料或者改變現(xiàn)有材料的結構和組成是非常有必要的。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的化學式為Ca10(PO4)6(OH)2，是一種組成與人體骨礦物質高度相似的物質[5]。HA可與人體骨細胞有效結合而不引起局部或全身的炎癥或異物反應[6]。因此，HA被廣泛應用于生物醫(yī)學領域，尤其是在骨科、齒科等方面作為某些金屬植入物的涂層材料[7-8]。目前常用來制備HA涂層的方法有：溶膠-凝膠法[9]、激光熔覆法[10]、微弧氧化法[11]、電泳沉積法[12]等，但通過這些方法制得的HA涂層機械性能較低，限制了這些生物涂層材料的應用。

區(qū)帶電泳(ZE)是常用的電泳手段。在區(qū)帶電泳的過程中，分散質粒子被均勻地分散在分散劑中，在電場的作用下分散質中的各微粒由于遷移速率的不同形成不同的區(qū)帶分布[13]。帶電微粒在分散劑中的定向移動，除了受電場的影響[14]，還受到分散質粒子與其固態(tài)載體吸附作用的影響[15]，因此帶電微粒達到的區(qū)帶分布效果是多種影響綜合后的結果。

我們采用區(qū)帶電泳/電泳沉積法(ZE/EPD)制備了一種新型HA/CS/ZnO/SiO2梯度涂層材料(CS：殼聚糖)，經710℃焙燒處理后得到多孔HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料，并采用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為探針測試梯度涂層粉末的抗菌性，同時將梯度涂層材料浸泡于HEPES模擬體液(H-SBF)中進行結晶轉化度的測試。實驗中同時僅通過電泳沉積法(EPD)制備了HA/ZnO/SiO2涂層材料作為對比。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

納米HA粉體為實驗室自制[16]。殼聚糖的脫乙酰度為96%。其余試劑(AR)均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 復合涂層材料的制備

按一定比例稱取HA、CS、ZnO、SiO2四種化合物共0.80 g，加入40 mL正丁醇、0.5 mL三乙醇胺，超聲30 min后得電泳懸浮液，懸浮液陳化24 h后，各微粒分布如圖1a所示。再將預處理過的鈦片作為電極置于懸浮液中，電極間距3.0 cm，區(qū)帶電泳電壓33 V，電泳時間7 min，懸浮液中的顆粒在電場的作用下在分散劑中達到圖1b所示的區(qū)帶分布效果。接著進行正負極轉換施以反向電場進行電泳沉積(ZE/EPD)，在原有的兩電極鈦片中插入新的鈦片作為陰極，原陰極鈦片作為陽極，施以33 V電壓，電泳沉積10 min，電極間距2.0 cm。電泳沉積后從懸浮液中取出陰極鈦片，分別用正丁醇以及無水乙醇浸洗后，得到HA/CS/ZnO/SiO2梯度涂層材料，如圖1c所示。在710℃下焙燒2 h得多孔HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料(Z1)，如圖1d所示。實驗中同樣采用未經區(qū)帶電泳分布的懸浮液直接進行電泳沉積制得相應的多孔HA/ZnO/SiO2涂層材料(E1)。

圖1 HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料制備過程示意圖Fig.1 Schematic diagram for preparation of HA/ZnO/SiO2 gradient coating material

1.3 復合涂層與鈦基的結合強度測試

將經710℃焙燒后得到的涂層材料用AB膠粘結在經過除油處理后的不銹鋼鋼片上，粘合面積為0.50 cm×1.00 cm，再根據 ASTMF1044-05標準用LP5K型萬能材料試驗機對粘結好的材料進行拉伸強度測試獲得涂層與鈦基材的結合強度。

1.4 復合涂層材料的電化學性能測試

實驗用CHI660C型電化學工作站，采用三電極體系(涂層材料作為測試電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑電極作為輔助電極)，用H-SBF作為電解質溶液，分別用循環(huán)伏安法測試2種材料的CV曲線，用Tafel Plot法測試2種材料在H-SBF中的Tafel極化曲線。

1.5 復合涂層的表征和抗菌活性實驗

取50 mL模擬體液(H-SBF)置于HH-2數顯恒溫水浴鍋中，控制水溫為(37.0±0.1)℃，將2種方法所制得的材料Z1與E1浸泡于H-SBF中進行培養(yǎng)，HSBF每48 h更換一次。待復合涂層材料浸泡7和14 d后分別取出，用二次蒸餾水洗滌，自然晾干。利用Avatar-360型傅里葉紅外光譜儀表征涂層材料的化學組成，樣品用KBr壓片制樣。用JSM-7500F掃描電子顯微鏡(日本JEOL公司)觀察培養(yǎng)后梯度涂層材料的表面形貌，工作電壓為5 kV。X射線能譜(EDS)也由JSM-7500F測試，工作電壓為5 kV。利用X射線衍射儀X'Pert-Pro-MPD(荷蘭Philips公司)表征晶相結構，檢測條件為銅靶(λ=0.154 18 nm)，電流40 mA，電壓40 kV，掃描速率為0.026(°)·s-1，掃描范圍2θ=10°～70°。并根據涂層表面結晶轉化的程度來判斷涂層材料的生物活性[17]，最后采用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為探針對HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料粉末進行抑菌性測試，細菌通過生化培養(yǎng)箱和恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海儀恒儀器有限公司)進行培養(yǎng)，凈化臺由蘇州凈化設備有限公司提供。抑菌率(Rin)計算公式為：Rin=(Nnocolony-Nwithcolony)/Nnocolony×100%，其中Nnocolony為無粉體平均菌落總數，Nwithcolony為含粉體平均菌落總數。

2 結果與討論

2.1 HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料的多孔結構及物相組成

圖2為710℃焙燒前后梯度涂層材料表面的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，圖A為HA/CS/ZnO/SiO2梯度涂層材料表面的SEM圖像，焙燒前HA/CS/ZnO/SiO2梯度涂層材料的表面均勻致密；圖B是經710℃焙燒2 h后得到的HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料表面的SEM圖像，焙燒后其表面凹凸不平，出現(xiàn)了明顯的孔洞。這是由于在710℃高溫條件下，殼聚糖微粒發(fā)生氧化分解產生CO2、水蒸氣等氣體，氣體逸出在材料的表面留下了孔洞，這些孔洞有利于營養(yǎng)物質的交換，并為骨骼的生長提供補給。

圖2 HA/CS/ZnO/SiO2梯度涂層材料燒結前后的SEM圖Fig.2 SEM images of HA/CS/ZnO/SiO2 gradient coatings before and after sintering treatment

圖3是HA/CS/ZnO/SiO2梯度涂層材料在710℃焙燒前后的X射線衍射(XRD)圖。與標準PDF卡片HA(PDF No.09-0432)和 ZnO(PDF No.36-1451)對比后發(fā)現(xiàn)，焙燒前的圖3a出現(xiàn)了六方晶系結構HA和六方纖鋅礦結構ZnO的特征衍射峰。710℃高溫焙燒后，HA的六方晶系結構未發(fā)生改變，說明高溫焙燒時殼聚糖顆粒的分解不會影響HA的晶型。圖3b中雖然出現(xiàn)了ZnO的特征衍射峰，但因含量低，衍射峰強度較弱。盡管在梯度涂層材料中添加了SiO2顆粒，但焙燒前后的XRD圖中均未出現(xiàn)SiO2的特征衍射峰，可能是梯度涂層材料中的SiO2以非晶態(tài)形式存在且其含量較少所致。另外，圖3b中未明顯出現(xiàn)硅酸鋅、磷酸鋅的特征衍射峰，說明梯度涂層材料中的ZnO和SiO2經高溫焙燒后未發(fā)生化學反應，ZnO仍以六方纖鋅礦結構形式存在，SiO2仍以非晶態(tài)形式存在。

圖3 HA/CS/ZnO/SiO2梯度涂層材料燒結前后的XRD圖Fig.3 XRD patterns of HA/CS/ZnO/SiO2 gradient coating materials before and after sintering treatment

2.2 HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料截面的元素梯度分布

焙燒后的HA/ZnO/SiO2復合涂層材料Z1截面各元素含量測試方法如圖4所示：在垂直于鈦片的徑向截面上選取6處，從涂層與鈦基材結合處由內向外開始編號，通過EDS測得各處的各元素含量后對各元素的含量進行線性擬合。

圖4 HA/ZnO/SiO2涂層材料斷面徑向圖Fig.4 Sectional view of HA/ZnO/SiO2 coating material in radial direction

圖5是從Z1截面中選取Ca、Si和Zn元素后整理所得其所在的位置與其質量分數的線性回歸曲線。經解析得Z1中徑向上Ca元素的回歸方程為y1=2.644x+9.83，Si元素的回歸方程為y2=0.115x+0.29，Zn元素的回歸方程為y3=-0.911x+15.43。由圖可知，Ca元素的含量隨著離鈦基的距離的增加而增加，涂層中的Ca元素來源于HA，因此可推斷HA的含量由鈦基內側到外側是逐漸增加的，HA主要附著在涂層的外側。Si元素來源于添加的SiO2微粒，Si元素的含量也隨著距離的增加而增加，故SiO2微粒主要在涂層的外側。Zn元素來源于ZnO微粒，由結果可知Zn元素的含量隨著距離的增加而降低，這意味著ZnO微粒在涂層的內側，離鈦基越近，ZnO的含量越高。上述測試結果初步說明Si和Zn元素在涂層材料中呈現(xiàn)梯度分布，通過ZE/EPD法制得的HA/ZnO/SiO2復合涂層材料Z1是具有梯度性質的。

圖5 HA/ZnO/SiO2涂層材料截面元素的回歸曲線Fig.5 Regression curves of elemental contents of HA/ZnO/SiO2 coating material

HA/ZnO/SiO2涂層材料中HA和SiO2微粒主要附著在涂層的外側，ZnO微粒在涂層的內側。這種梯度分布主要受各種微粒遷移速度的不同與行程差(圖 1b中的δ)的影響。實驗添加的SiO2、ZnO、CS及HA微粒在三乙醇胺的正丁醇溶液中都呈現(xiàn)正電性，這些微粒在電場作用下一致向負極移動。實驗中首先進行區(qū)帶電泳，由于各微粒的遷移速度的不同，在懸浮液體系形成有效的濃度梯度層，接著通過變換正負極施加反向電場后，懸浮液中的SiO2、ZnO、CS和HA顆粒又因電泳遷移行程差的不同，在電泳沉積過程中形成了具有梯度分布的涂層材料。

2.2 HA/ZnO/SiO2梯度涂層與鈦基的結合強度測試

五種涂層與鈦基材的結合強度測試結果如圖6所示。從圖6可以看出，將HA與ZnO和SiO2兩種組分結合可以提高HA涂層與鈦基的結合強度，且具有梯度的HA/ZnO/SiO2復合涂層材料Z1比無梯度的E1高出3.3 MPa。這可能是由于化合物ZnO和SiO2的添加，緩解了HA與金屬Ti基材之間的熱膨脹系數不匹配的現(xiàn)象[18]；且添加的元素Zn和Si在靠近鈦基一側，HA在涂層外側，這種梯度分布使得涂層與鈦基的結合強度得以明顯提升。

圖6 五種復合涂層與鈦基的結合強度Fig.6 Bonding strengths of five composite coatings with Ti

2.3 HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料的電化學性能測試

圖7是HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料在H-SBF中的CV圖。由圖7可見，梯度涂層材料的CV曲線未見明顯的氧化還原峰，這表明HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料(Z1)在H-SBF中化學性質較為穩(wěn)定，在測試的電勢范圍(-2.4～1.5 V，vs SCE)內不發(fā)生氧化還原反應[16]，適合作為人體植入材料。

圖7 HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料在H-SBF中的CV圖Fig.7 CV curve of HA/ZnO/SiO2 gradient coating material in H-SBF

圖8是3種材料在自制H-SBF電解液中的Tafel極化曲線。其中a、b、c分別是HA涂層材料、HA/ZnO/SiO2涂層材料(E1)、HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料(Z1)在H-SBF模擬體液中的Tafel極化曲線。表1是由圖8經軟件處理后得到的自腐蝕電位(Vcorr，vs SCE)以及自腐蝕電流密度(Jcorr)。由圖8以及表1可以看出HA/ZnO/SiO2涂層材料、HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料的自腐蝕電流密度均小于單組分的純HA涂層材料，且HA/ZnO/SiO2復合涂層材料E1和Z1的自腐蝕電位都發(fā)生了正移：Z1正移0.173 V，E1正移0.071 V。這說明HA/ZnO/SiO2梯度材料Z1的耐腐蝕性強于E1，意味著HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料Z1在H-SBF的耐腐蝕性更佳。

圖8 三種涂層材料在H-SBF中的Tafel極化曲線Fig.8 Tafel polarization curves of three coating materials in H-SBF

表1 三種涂層材料在H-SBF中的自腐蝕電位及自腐蝕電流密度Table 1 Self-corrosion potentials and self-corrosion current densities of three coatings materials in H-SBF

2.4 HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料的抑菌效果

將Z1從鈦片上剝離后，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為測試探針，對該梯度涂層粉末進行抑菌率的測試，實驗中其測試結果如圖7所示。圖9A和B是HA/ZnO/SiO2梯度材料粉末對大腸桿菌的抑菌率實驗，A為不加粉末的對照組，B是加入粉末的實驗組。經37℃培養(yǎng)24 h后對比可知，加入涂層粉末后菌落數明顯減少，經抑菌率公式計算出HA/ZnO/SiO2粉末對大腸桿菌的抑菌率為81.7%。圖9C和D為HA/ZnO/SiO2梯度材料粉末對金黃色葡萄球菌的抑菌率實驗結果圖，C為不加粉末的對照組，D是加入HA/ZnO/SiO2粉末的實驗組。通過對比發(fā)現(xiàn)，Z1粉末具有較好的抑菌效果，其抑菌率達到89.4%。由于涂層材料中的HA沒有抑菌作用，所以其抑菌性可能來自ZnO，ZnO在水中可以激發(fā)出活性基團-OH，羥基可通過多步反應轉換成超氧陰離子自由基(·O2-)和H2O2等活性氧物質[19]，產生的活性氧物質可以使細菌的細胞膜受損，導致溶菌現(xiàn)象的出現(xiàn)甚至使細菌死亡[20]，故而HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料具有一定的抑菌效果。另外，實驗發(fā)現(xiàn)，Z1粉末對金黃色葡萄球菌的抑菌效果高于大腸桿菌的抑菌效果，這說明不同的細菌對Z1粉末有不同的敏感程度。

2.5 HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料在H-SBF中的結晶轉化

圖10為經710℃燒結后HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料在37℃的H-SBF中浸泡7 d(A)和14 d(B)后材料表面SEM圖。從圖10A可以看到，表面為多孔的HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料在H-SBF中浸泡7 d后，材料表面大部分區(qū)域呈類魚鱗狀，材料表面有粗糙的孔洞。當HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料在H-SBF中浸泡至14 d后(圖10B)，可以觀察到圓形魚鱗物質消失，整個材料表面呈現(xiàn)類魚皮狀。這是因為在浸泡過程中，復合涂層HA中的PO43-與H-SBF溶液中的CO32-發(fā)生離子交換，形成碳酸羥基磷灰石覆蓋在材料的表面，且碳酸羥基磷灰石含量隨著浸泡時間的增加而增長。另外，碳酸羥基磷灰石優(yōu)先在涂層有孔洞處生成，這是由于孔洞附近有利于物質交換，能夠為碳酸羥基磷灰石的沉積提供質點。

圖9 HA/ZnO/SiO2涂層材料粉末的抑菌性實驗圖片F(xiàn)ig.9 Experiment picture for antibacterial properties of HA/ZnO/SiO2 coating material powders

圖10 HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料在H-SBF中培養(yǎng)7 d(A)和14 d(B)后的SEM圖Fig.10 SEM images of HA/ZnO/SiO2 gradient coating materials cultured in H-SBF for 7 d(A)and 14 d(B)

圖11為Z1在H-SBF中分別培養(yǎng)0 d(a)、7 d(b)和14 d(c)后的傅里葉變換紅外(FT-IR)譜圖。由圖可知，隨著培養(yǎng)天數的增加，3 575 cm-1處的源于HA的O-H振動吸收峰出現(xiàn)弱化現(xiàn)象，964 cm-1處的PO43-的振動吸收峰隨培養(yǎng)天數增加而漸漸減弱，位于 1 000～1 100 cm-1處的 PO43-的吸收峰逐漸變寬，1 420～1 450 cm-1及 873 cm-1處出現(xiàn)了 CO32-的特征吸收峰。這種情況的出現(xiàn)是由于HA部分的OH-與PO43-被CO32-取代，導致HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料中磷酸鹽的對稱性降低。這進一步說明HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料的表面有碳酸羥基磷灰石的沉積，該梯度涂層材料在H-SBF中發(fā)生了結晶轉化。

圖11 HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料在H-SBF中培養(yǎng)0 d(a)、7 d(b)和14 d(c)的FT-IR譜圖Fig.11 FT-IR spectra of HA/ZnO/SiO2 gradient coating materials immersed in H-SBF for 0 d(a),7 d(b)and 14 d(c)

圖12是HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料在H-SBF模擬體液中培養(yǎng)0 d(a)、7 d(b)和14 d(c)后的XRD圖。從圖中可以看出，經H-SBF培養(yǎng)后，涂層材料中HA的衍射峰形狀和位置并未發(fā)生變化，說明培養(yǎng)后HA的晶型不變；但衍射峰強度隨著培養(yǎng)天數的增長而逐漸減弱。這種弱化現(xiàn)象的出現(xiàn)，證實培養(yǎng)后部分HA發(fā)生了結晶轉化，致使HA的含量下降并轉化為碳酸羥基磷灰石，碳酸羥基磷灰石是一種弱結晶的物質，覆蓋在材料的表面。

圖12 HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料在H-SBF培養(yǎng)0 d(a)、7 d(b)和 14 d(c)的 XRD 圖Fig.12 XRD patterns of HA/ZnO/SiO2 gradient coating materials immersed in H-SBF for 0 d(a),7 d(b)and 14 d(c)

3 結論

通過先區(qū)帶電泳分布后電泳沉積(ZE/EPD)制備的HA/CS/ZnO/SiO2梯度涂層材料，經710℃焙燒2 h后制得多孔HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料(Z1)。EDS測試表明Si和Zn元素在涂層Z1徑向上呈現(xiàn)梯度分布，初步說明采用ZE/EPD法制得的涂層材料是具有一定梯度的。對梯度涂層材料進行性能測試發(fā)現(xiàn)：HA/ZnO/SiO2梯度涂層與Ti基材的結合強度達31.2 MPa；Z1在H-SBF中培養(yǎng)14 d后涂層材料表面發(fā)生結晶轉化，形成了碳酸羥基磷灰石；電化學測試結果表明，Z1在H-SBF中的耐腐蝕能力更佳；Z1粉末對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌率分別為81.7%和89.4%。這些結果可以說明，HA/ZnO/SiO2梯度涂層材料(Z1)與直接電泳沉積制得的HA/ZnO/SiO2復合涂層材料(E1)比較，具有更高的結合強度和較為優(yōu)異的體外抗菌活性，更加適合用作人體骨替代的材料。