高標(biāo) ，李相磊 ，馬春燕 ，黃利娜 ，劉妍 ，高園林

（開封市中心醫(yī)院1.檢驗科；2.神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475001）

腦膜癌病（Meningeal carcinomatosis，MC）又稱腦膜轉(zhuǎn)移癌或癌性腦膜炎，在實體腫瘤患者中患病率約為4%～15%，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移瘤特殊分布類型之一，是腫瘤細(xì)胞通過血行轉(zhuǎn)移或腦脊液散播浸潤腦膜和脊髓膜，隨血管周圍間隙侵入大腦皮質(zhì)而發(fā)生一種惡性病變，臨床表現(xiàn)為腦、脊髓受損和腦神經(jīng)癥狀， 是惡性腫瘤致死的重要原因之一[1，2]。MC 起病隱匿，轉(zhuǎn)移形式較為特殊，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且一般顱內(nèi)無實質(zhì)性病變，影像學(xué)檢查缺乏特異性，臨床診斷較為困難，易發(fā)生漏診和誤診，影響患者預(yù)后。本研究選取55 例MC 患者，以所有患者腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）為檢測基礎(chǔ)，分析CSF 細(xì)胞學(xué)在MC 中應(yīng)用價值，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測上皮膜抗原（EMA）、細(xì)胞角蛋白20（CK20）、癌胚抗原（CEA）、新天冬氨酸蛋白酶 A（Napsin A）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子（TTF-1）、細(xì)胞角蛋白7（CK7）6 種腫瘤標(biāo)記物在 CSF 中定位表達，為尋找MC 原發(fā)灶提供依據(jù)，報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取 2013 年 8 月-2018 年 11 月我院收治的55 例MC 患者，均根據(jù)癥狀體征、影像學(xué)檢查、CSF 細(xì)胞學(xué)檢查證實，并簽署知情同意書，排除預(yù)估生存期＜6 個月者、休克者、可疑顱內(nèi)占位病變、腦疝、凝血功能障礙患者，其中男26 例，女29例，年齡 38～78 歲，平均 50.18±6.09 歲，發(fā)病至確診時間 7～129d， 平均 55.79±27.90d。 本研究符合《世界醫(yī)學(xué)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器 羅氏COBAS C702 全自動生化分析儀購置于美國羅氏公司；FMU-6 細(xì)胞涂片離心沉淀儀購置于西安安美生物科技有限公司； 細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)及奧林巴斯CX31 型光學(xué)顯微鏡均購置于上海北昂醫(yī)療技術(shù)有限公司。

1.2.2 主要試劑 瑞吉氏染液購置于珠海索貝生物技術(shù)有限公司；鼠抗人EMA 單克隆抗體；鼠抗人CK20 單克隆抗體；鼠抗人CEA 單克隆抗體；鼠抗人Napsin A 單克隆抗體； 鼠抗人TTF-1 單克隆抗體（8G7G3/1）；鼠抗人CK7 單克隆抗體均購于北京中杉科技有限公司。

1.2.3 CSF 常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查 腰椎穿刺第3 管進行細(xì)胞學(xué)檢查，留取5mL 腦脊液，采用改良牛鮑氏計數(shù)盤進行白細(xì)胞計數(shù)，應(yīng)用玻片離心沉淀法，收集CSF 細(xì)胞玻片 7 張。

1.2.4 CSF 生化檢查 腰椎穿刺第2 管， 進行蛋白含量、葡萄糖含量、氯化物水平檢測。

1.2.5 CSF 細(xì)胞學(xué)、 免疫組化染色檢查 標(biāo)本均嚴(yán)格按SOP 文件操作。

1.2.6 結(jié)果判定 ⑴瑞吉氏染色陽性標(biāo)準(zhǔn): 發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。 細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點：細(xì)胞大小不一，細(xì)胞體大，胞核常偏向一側(cè)，胞漿著色變深，富含空泡，多為藍色，黑色素瘤細(xì)胞漿內(nèi)顯示黑色素顆粒沉著，部分患者可顯示絲狀分裂，核漿比例增大，核仁清晰，核染色質(zhì)變粗，染色加深，核異型明顯，雙核或多核，腫瘤細(xì)胞較多患者細(xì)胞聚集為團簇狀，見圖1、2。⑵TTF-1 陽性標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)存在表達時，細(xì)胞核表達強度高于細(xì)胞質(zhì)方可評定為陽性； ⑶EMA、CK20、CEA、Napsin A、CK7 陽性標(biāo)準(zhǔn)：未分化或低分化腺癌EMA 主要分布于細(xì)胞漿中， 高分化腺癌EMA 呈膜型分布，細(xì)胞膜、胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，彌漫性非顆粒狀細(xì)胞質(zhì)染色判為陰性，CK20、CEA、Napsin A、CK7 胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。

圖1

圖2

1.3 觀察指標(biāo) ⑴瑞吉氏染色結(jié)果。 ⑵臨床癥狀、腦脊液常規(guī)與生化檢查、腫瘤原發(fā)病灶分布情況。⑶EMA、CEA、CK7 診斷 MC 靈敏度、 陽性預(yù)測值。⑷EMA、CK20、CEA、Napsin A、TTF-1、CK7 在原發(fā)灶中陽性表達率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示、t 檢驗，計數(shù)資料用 n（%） 表示、χ2檢驗。 P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瑞吉氏染色結(jié)果 55 例MC 患者瑞吉氏染色結(jié)果均為陽性，其中 27 例（49.09%，27/55）首次腰穿發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，28 例（50.91%，28/55）經(jīng)反復(fù)腰穿發(fā)現(xiàn)。

2.2 臨床癥狀、CSF 常規(guī)與生化檢查、 腫瘤原發(fā)灶分布情況 MC 首發(fā)癥狀以頭痛（83.64%）、惡心/嘔吐（78.18%）、精神改變（78.18%）、腦膜刺激征（63.6 4%）、意識不清（47.27%）、聽神經(jīng)受累（32.73%）為主， WBC、蛋白含量、葡萄糖含量、氯化物水平均伴有不同程度異常，腫瘤原發(fā)灶為肺癌（34.55%）、乳腺癌（25.45%）、胃癌（21.82%）、卵巢癌（18.18%），見表1。

表1 臨床癥狀、CSF 常規(guī)與生化檢查、腫瘤原發(fā)灶分布情況(n=55)

2.3 診斷 MC 情況 55 例 MC 患者中，EMA 陽性45 例，CEA 陽性 29 例，CK7 陽性 33 例，EMA+CEA陽性 47 例，EMA+CK7 陽性 50 例，EMA+CEA+CK7陽性 53 例 。 EMA、CEA、CK7、EMA+CEA、EMA+CK7、EMA+CEA+CK7 檢測陽性預(yù)測值均為100%，靈敏度比較差異顯著（P＜0.05）；EMA+CEA+CK7 檢測靈敏度高于任何單一或兩兩聯(lián)合靈敏度 （P＜0.05）。 見表2。

表2 各指標(biāo)診斷靈敏度與陽性預(yù)測值（n=55）

2.4 各指標(biāo)在原發(fā)灶中陽性表達率 EMA 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌中陽性表達率比較無顯著差異（P＞0.05）；CK7 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌中陽性表達率比較差異顯著 （P＜0.05）；CK20 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌中陽性表達率均為0，低于胃癌中陽性表達率 25.00%（P＜0.05）；CEA 在乳腺癌中陽性表達率為0，低于胃癌、卵巢癌、肺癌中陽性表達率 66.67%、100.00%、52.63%（P＜0.05）；Napsin A 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中陽性表達率均為0，低于肺癌中陽性表達率 84.21%（P＜0.05）；TTF-1 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中陽性表達率均為0，低于肺癌中陽性表達率 73.68%（P＜0.05）。 見表3。

3 討論

MC 好發(fā)于中老年人群，病情進展較快，早期診斷對改善患者預(yù)后具有積極意義。 MC 臨床癥狀表現(xiàn)出多樣化，本研究中首發(fā)癥狀以頭痛、惡心/嘔吐、精神改變、腦膜刺激征、意識不清、聽神經(jīng)受累為主，其中頭痛占83.64%，患者多為陣發(fā)性頭痛，較為劇烈， 以轉(zhuǎn)移性疼痛或全頭部脹痛為表現(xiàn)形式，隨著疾病進展，頭痛時間逐漸延長，出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)，嚴(yán)重者可伴有噴射性嘔吐，63.64%患者早期即出現(xiàn)腦膜刺激征，其原因與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至腦膜后導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)，誘發(fā)顱內(nèi)壓變化，影響腦脊液循環(huán)有關(guān)。 當(dāng)癌細(xì)胞隨血管間隙進入腦實質(zhì)，可出現(xiàn)精神變化、意識障礙，當(dāng)癌細(xì)胞侵犯脊神經(jīng)和腦神經(jīng)，可導(dǎo)致聽神經(jīng)受累、視力障礙等[3，4]。但以上特征表現(xiàn)在較多疾病中均可呈現(xiàn)，缺乏特異性，單一依賴臨床癥狀無法對MC 進行診斷。

以往研究證實，MC 患者常表現(xiàn)為壓力增高，白細(xì)胞計數(shù)輕度增高或正常，蛋白含量增加，葡萄糖與氯化物水平降低[5-7]。 本研究CSF 常規(guī)檢查與生化檢查中，72.73% MC 患者壓力增高，WBC 水平均低于100×106/L，70.91%患者蛋白含量低于0.45 g/L，72.73%患者葡萄糖含量低于 2.5mmoL/L，52.73%患者氯化物水平低于118mmoL/L，與以往研究基本相符，但這些特征易與腦膜炎混淆，因此需進行CSF 細(xì)胞學(xué)檢查明確診斷。 米芳等[8]研究指出，CSF 癌細(xì)胞第一次腰穿后陽性率為45%左右，第二次腰穿陽性率為80%左右，3 次腰穿后陽性率在90%以上。 本研究55 例患者瑞吉氏染色結(jié)果均為陽性，其中49.09%首次腰穿發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，其余患者經(jīng)反復(fù)腰穿發(fā)現(xiàn)， 提示反復(fù)腰穿進行CSF 細(xì)胞學(xué)檢查有助于提高診斷陽性率。此外MC 病理類型以腺癌、鱗癌為主，文獻報道指出，MC 原發(fā)灶來源日本主要為胃癌，歐美主要為乳腺癌，國內(nèi)以肺癌為首[9，10]。 本研究結(jié)果顯示腫瘤原發(fā)病灶肺癌占34.55%，乳腺癌占25.45%、胃癌占21.82%、卵巢癌占18.18%，與以上報道相符。

目前CSF 細(xì)胞學(xué)檢查被認(rèn)為是診斷疾病金標(biāo)準(zhǔn)，但腫瘤細(xì)胞不一定出現(xiàn)在CSF 中，故首次腰穿陽性率較低。 既往資料顯示，14.3% MC 患者需進行反復(fù)多次腰穿才可發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞[11]。分析其原因可能為：⑴疾病早期癌細(xì)胞脫落至CSF 數(shù)量較少；⑵MC 以軟腦膜受累較為常見，腰穿留取標(biāo)本相距軟腦膜較遠，一次腰穿不能反應(yīng)疾病狀態(tài)；⑶CSF 流暢不通，腫瘤細(xì)胞分布不均勻，具有一定隨機性。因此對疑似MC 患者進行反復(fù)多次腰穿對疾病早期診斷是必要的。 常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查以細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點為診斷基礎(chǔ)，具有簡單直觀特點，但癌細(xì)胞多附于腦膜脊膜或漂浮于腦脊液， 增生繁殖無束縛性，形態(tài)特征發(fā)生了變化，部分癌細(xì)胞異型性不明顯，較難與退化細(xì)胞、反應(yīng)性細(xì)胞區(qū)分，且MC 原發(fā)腫瘤類型較多，依靠單一CSF 細(xì)胞形態(tài)難以明確原發(fā)病灶[12]。

表3 各指標(biāo)在原發(fā)灶中陽性表達率（n=55）

EMA 存在于各種類型正常上皮中， 在上皮分化腫瘤、某些惡性淋巴瘤中亦有表達；CEA 廣泛存在于各種上皮樣腫瘤；CK7 表達于上皮源性原發(fā)與轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞、正常上皮中，因為其細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中保持免疫學(xué)特性和亞微結(jié)構(gòu)，故可用于鑒別癌細(xì)胞來源[13]； CK20 被認(rèn)為是膀胱移行上皮腫瘤和胃腸道腫瘤較為特異的標(biāo)志[14]；Napsin A 特異性表達于正常腎和肺中，腫瘤組織中，其多表達于肺癌[15]；TTF-1 主要表達于細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、 肺泡細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞等[16]。 本研究嘗試采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測6 種腫瘤標(biāo)記物在CSF 中定位表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn) EMA、CEA、CK7、EMA+CEA、EMA+CK7、EMA+CEA+CK7 診斷MC 陽性預(yù)測值均為100%，EMA+CEA+CK7 診斷MC 靈敏度高于任何單一或兩兩聯(lián)合靈敏度（P＜0.05），提示 EMA+CEA+CK7 聯(lián)合檢測可對MC 進行輔助性診斷。 而CK20 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌中陽性表達率均為0，低于胃癌中陽性表達率 25.00%（P＜0.05），說明 CK20 陽性提示MC 原發(fā)灶為胃癌可能性較大；CEA 在乳腺癌中陽性表達率為0，低于胃癌、卵巢癌、肺癌中陽性表達率 66.67%、100.00%、52.63%（P＜0.05）， 說明 CEA陰性提示原發(fā)灶為乳腺癌可能性較?。籒apsin A在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中陽性表達率均為0，低于肺癌中陽性表達率 84.21%（P＜0.05），說明 Napsin A陽性提示原發(fā)灶為肺癌可能性較大；TTF-1 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中陽性表達率均為0，低于肺癌中陽性表達率 73.68%（P＜0.05）， 說明 TTF-1 陽性提示原發(fā)灶為肺癌可能性較大。

綜上所述，MC 臨床表現(xiàn)缺乏特異性，對于CSF常規(guī)檢查與生化檢查異常中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變患者應(yīng)開展CSF 細(xì)胞學(xué)檢查，EMA+CEA+CK7 可用于MC 輔助性診斷，CK20、CEA、Napsin A、TTF-1 有助于MC 原發(fā)灶鑒別。 本研究不足之處是因CSF標(biāo)本留取量較少，未對6 種腫瘤標(biāo)記物進行各種組合免疫組化，取得成果仍需大樣本量實驗驗證。