張衛(wèi)忠,施春花,王友蓮
(江西省人民醫(yī)院風濕免疫科,南昌330006)
別嘌醇是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑, 能有效減少尿酸合成,作為降尿酸藥物療效顯著、價格低廉,在臨床上廣泛用于治療高尿酸血癥、痛風和痛風性關節(jié)炎等疾病。 然而在使用過程中,別嘌醇容易引起各種不良反應,有常見的藥疹、發(fā)熱、肝腎功能損害及血液系統(tǒng)損害[1];也有嚴重的皮膚不良反應, 如中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis,TEN)、 重 癥 滲 出 性 多 形 紅 斑 藥 疹(Stevens-Johnson syndrome,SJS) 及超敏綜合征(hypersensitivity syndrome,HSS)等,發(fā)病率約5%,病死率高達30%-50%[2]。 近年來,別嘌醇的過敏反應成為國內(nèi)外學者關注的熱點。 2005 年,Hung 等[3]報道臺灣人群使用別嘌醇治療而產(chǎn)生嚴重不良反應與HLA-B*5801 等位基因之間存在相關性, 隨后國內(nèi)外文獻[4-7]也有相關報道。2013 年的《高尿酸血癥和痛風治療中國專家共識》中推薦痛風及高尿酸血癥患者使用別嘌醇前檢測HLA-B*5801 基因。最新的美國臨床藥理學治療指南[8]也提出在口服別嘌呤醇之前對患者進行HLA-B*5801 基因型檢測是很有必要的, 等位基因型陽性者不主張服用別嘌醇,建議服用其他替代藥物。 但是不同地區(qū)、國家、 種族之間,HLA-B*5801 基因攜帶情況以及其別嘌醇相關藥疹之間的關聯(lián)性差異很大, 而且中國很多地區(qū)缺乏HLA-B*5801 基因攜帶情況的研究分析, 尤其是江西省內(nèi)各地區(qū)缺乏該基因流行性的調查。而且很少有醫(yī)院開展該基因檢測。由于HLA-B*5801 基因檢測比較昂貴, 很多痛風及高尿酸血癥患者考慮經(jīng)濟原因對該項檢測比較顧慮。 本研究希望通過調查南昌市痛風及高尿酸血癥患者HLA-B*5801 基因攜帶情況及與別嘌醇相關藥疹之間的相關性, 來指導本地痛風及高尿酸血癥患者選用合適藥物治療。
1.1 研究對象 研究對象為在2018 年6 月至2019年1 月期間就診于江西省人民院的痛風及高尿酸血癥患者。 其中痛風的診斷標準參考2015 年美國風濕病學會/歐洲抗風濕聯(lián)盟痛風分類標準[9];高尿酸血癥診斷標準: 男420μmol/L (7mg/L), 女360 μmol/L(6mg/L)。入選患者年齡18-75 歲。將服用別嘌醇的痛風及高尿酸血癥患者分為兩組, 其中服用別嘌醇而過敏的11 例患者納入別嘌醇過敏組;服用別嘌醇超過6 個月但未發(fā)生任何不良反應的患者21 例納入別嘌醇耐受組;在江西省人民醫(yī)院就診且未服用過別嘌醇的痛風及高尿酸血癥患者共80 例納入對照組。 詳細記錄受試者的相關資料,包括性別、年齡、家庭住址、民族、臨床診斷、藥物使用情況、 出現(xiàn)的藥物不良反應情況及相應的治療情況等。 所有受試者均知情同意并簽署了知情同意書,且通過醫(yī)院倫理委員會的審核批準。
1.2 方法 使用EDTA 抗凝管采集各受試者靜脈血3mL,提取血液DNA,并測定DNA 濃度和純度,利用安徽同科生物科技有限公司的人類HLAB*5801 基因檢測試劑盒(PCR 多色熒光法) 進行HLA-B*5801 等位基因檢測。 其中該試劑盒針對HLA-B*5801 等位基因設計了一套特異性引物和探針組合, 在一個反應體系中利用兩熒光通道檢測目標基因。 在反應體系含有對應基因型模板的情況下,PCR 反應得以進行,并利用熒光定量PCR儀對反應過程中釋放出的相應熒光信號進行實時檢測和輸出,實現(xiàn)HLA-B*5801 等位基因的檢測。其中JOE 熒光為內(nèi)參基因信號,ROX 和FAM 為HLA-B*5801 等位基因信號。檢測過程中所有操作均由經(jīng)培訓后的專人嚴格按照試劑盒說明書進行。
結果判讀:FAM、JOE 和ROX 的Ct 值均≤38,HLA-B*5801 陽性; 其中JOE≤38,F(xiàn)AM 或ROX不均≤38,HLA-B*5801 陰性;若JOE(內(nèi)參)Ct 值>38,可能存在PCR 抑制,需對樣本進行復測。
1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析, 計數(shù)資料比較采用Fisher確切概率法和卡方檢驗。HLA-B*5801 等位基因與別嘌醇過敏間的關聯(lián)強度使用比值比 (odds ratio,OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)反映。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。HLA-B*5801 等位基因陽性判斷別嘌醇過敏的敏感度=別嘌醇過敏組HLA-B*5801 陽性數(shù)/別嘌醇過敏組總人數(shù)×100%;HLA-B*5801 等位基因陰性判斷別嘌醇耐受的特異度=別嘌醇耐受組HLA-B*5801 陰性數(shù)/別嘌醇耐受總人數(shù)×100%。
2.1 HLA-B*5801 等位基因檢測情況 所有受試者的內(nèi)參基因(JOE)全部擴增,且Ct 值均<38,受試者檢測結果根據(jù)HLA-B*5801 檢測試劑盒的說明書進行判讀。 112 位受試者中,HLA- B*5801 等位基因陽性23 例(占20.5%),其中男性有16 例,女性7 例;HLA- B*5801 等位基因陰性89 例(占79.5%),其中男56 例,女33 例,檢測結果見表1。
表1 HLA-B*5801 等位基因檢測情況n(%)
圖1 HLA-B*5801 基因檢測擴增圖(左:陽性/右:陰性)
在檢測結果中, 隨機選取了HLA-B*5801 等位基因陽性、陰性的擴增結果各1 例,見圖1。由圖知,兩受試者的內(nèi)參基因(JOE)熒光通道均有曲線擴增,Ct 值在34 左右,小于38,檢測有效,其中一受試者的HLA-B*5801 基因(FAM 和ROX)熒光通道有擴增曲線,Ct 值在32 左右, 小于38,HLAB*5801 等位基因陽性; 而另一受試者的HLAB*5801 基因(FAM 和ROX)熒光通道無擴增曲線,HLA-B*5801 等位基因陰性。
2.2 別嘌醇過敏與HLA-B*5801 基因相關性 別嘌醇過敏組受試者HLA-B*5801 等位基因陽性率為90.9%(10/11), 別嘌醇耐受組受試者HLAB*5801 等位基因陽性率為9.5%(2/21),對照組受試者HLA-B*5801 等位基因陽性率為13.8%(11/80); 別嘌醇過敏組與別嘌醇耐受組比較,HLAB*5801 等位基因陽性者發(fā)生別嘌醇過敏的風險是HLA-B*5801 等位基因陰性者的95 倍 (OR=95,95% CI:7.6-1180.3,P<0.001), 該基因陽性判斷別嘌醇過敏的敏感度為90.9%,該基因陰性判斷別嘌醇耐受的特異度為90.5%。別嘌醇過敏組與健康對照組比較,HLA-B*5801 等位基因陽性者發(fā)生別嘌醇過敏的風險是HLA-B*5801 等位基因陰性者的62.7 倍(OR=62.7,95% CI:7.3-539.5,P<0.001)(表2)。
表2 各組攜帶HLA-B*5801 等位基因情況
在本研究中,健康對照組HLA-B*5801 等位基因陽性率為13.8%, 與國內(nèi)人群的陽性率14%-20%[3-5]相似,顯著高于歐洲(0.8%)及日本(0.6%)[2],但低于曾大勇[10]等的研究(20.4%),與不同地區(qū)人群的HLA-B*5801 等位基因攜帶率有差異理論相符[11]。 關于不同地區(qū)有不同的攜帶率的研究,后續(xù)可針對不同地域區(qū)內(nèi)的受試者進行深入探究。HLA-B*5801 該標志基因的危險度(OR=95)低于Hung 等[3](OR=580.3)及高杰等[2](OR=403),但 高于曾大勇等[10](OR=65.6),可能與研究的樣本數(shù)量及區(qū)域位置有關, 該研究證明HLA-B*5801 等位基因與別嘌醇過敏之間有關聯(lián)。
研究所用的實時熒光定量PCR 技術是在反應體系中加入針對HLA-B*5801 等位基因設計了一套特異性引物和探針組合, 且反應體系中加入了對內(nèi)參基因的檢測,能夠更好的對樣本DNA 的提取及擴增進行監(jiān)控,避免假陰性結果,提高試驗數(shù)據(jù)準確性。 熒光定量PCR 比常規(guī)PCR 特異性更強、靈敏度更高、分析結果快速,而且整個PCR 反應過程均在完全閉管狀態(tài)下進行, 無需冗長的后處理, 有效避免了常規(guī)PCR 產(chǎn)物造成的潛在實驗室污染問題。
近年來,由于肥胖、腎功能不全及高血壓發(fā)病率逐年上升,高尿酸血癥及痛風的發(fā)病率也隨之上升。根據(jù)《2016 年中國痛風指南》[12],我國不同地區(qū),不同時間段痛風患病率在1%-3%, 且呈逐年上升趨勢[13]。別嘌醇作為降尿酸、治療痛風的一線藥物,特別受人們的青睞,然而別嘌醇引起的嚴重過敏反應成為臨床應用的難題。 在江西地區(qū),痛風及高尿酸血癥的發(fā)病率高, 但存在很多患者未規(guī)律就診,包括不規(guī)范使用藥物及監(jiān)測血尿酸指標等。 在使用別嘌醇前很少患者曾檢測過HLA-B*5801 等位基因,存在用藥風險[14]。 本研究及其他研究[2-3,5-7,15,16]都已證實HLA-B*5801 等位基因與別嘌醇過敏有很強的相關性, 且HLA-B*5801 等位基因陽性率在亞裔漢族人群中具有相當高的比例[14],對即將服用別嘌醇的病患者進行HLA-B*5801 等位基因的檢測,有助于降低別嘌醇過敏反應的發(fā)生,指導患者安全合理用藥。