陳曉涵，吳姣姣，潘舒心，劉艷晶，施建忠，鄧國華，包紅梅，陳化蘭，曾顯營，田國彬

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

2013 年春季，我國首次出現(xiàn)人感染H7N9 流感病毒并死亡的公共衛(wèi)生事件[1]。流行病學調(diào)查結果顯示，感染病例多與活禽市場暴露有關，活禽市場家禽中也分離到H7N9 亞型禽流感病毒（AIV），其基因組與人源H7N9 流感病毒高度同源[2]；但該病毒對家禽呈低致病力，家禽感染后無臨床癥狀，難以被發(fā)現(xiàn)，極易在家禽中傳播[3]。2013 年5 月～2017 年1月，我國已有17 個省份的活禽市場或家禽養(yǎng)殖場中分離到H7N9 亞型AIV[4]。同時，2013 年～2017 年的冬春季節(jié)我國連續(xù)出現(xiàn)5 波人H7N9 流感疫情，引起社會廣泛關注。世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)顯示，截止2017 年9 月，我國共有1 564 人感染H7N9 流感病毒病例，其中615 人死亡，疫情也同時給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。2017 年初，H7N9 亞型AIV由低致病力突變?yōu)楦咧虏×4]，并在多個省份家禽中引起疫情。同時，對家禽呈高致病力的H7N9 亞型AIV 容易在哺乳動物體內(nèi)發(fā)生適應性突變，提高了其致病力及在哺乳動物間的傳播能力，對人類健康蘊藏更大威脅[5]。因此，控制家禽H7N9 亞型禽流感疫情和清除家禽中H7N9 亞型AIV 迫在眉睫。

疫苗免疫是禽流感防控的重要措施和關鍵環(huán)節(jié)。國家禽流感參考實驗室利用反向遺傳操作技術研制的一系列H5N1 亞型重組AI 滅活疫苗已在家禽中大量使用，控制了我國2004 年以來的H5N1 亞型禽流感疫情[6]。針對H7N9 亞型AIV 對家禽養(yǎng)殖業(yè)和人類健康的嚴重危害，國家禽流感參考實驗室利用反向遺傳操作技術，先后構建出以H7N9 亞型AIV HA 和NA 基因為重組病毒表面供體基因，以H1N1/PR8 病毒的M、NP、NS、PA、PB1、PB2 基因為內(nèi)部基因供體的重組AIV：H7-Re1 株和H7-Re2 株。本研究對這2 株重組AIV 的生物學特性和免疫原性進行評估，以期為H7N9 亞型禽流感疫苗的研制和應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 3 株H7 亞型AIV：A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013（簡 稱PG/SHH/S1069/13）、 A/Chicken/Guangxi/SD098/2017（簡 稱CK/GX/SD098/17）和A/Duck/Fujian/SE0195/2018（簡稱DK/FJ/SE0195/18），均為中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室純化、鑒定和保存，病毒含量分別依次為107.83EID50/0.1 mL、108.50EID50/0.1 mL、108.38EID50/0.1 mL。H7N9 亞型重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株均由國家禽流感參考實驗室構建，重組AIVH7-Re1 株的HA 和NA 基因來源于H7N9 亞型AIV（PG/SHH/S1069/13）株；重組AIV H7-Re2 株的HA 和NA 基因分別來源于H7N9 亞型AIV CK/GX/SD098/17株和PG/SHH/S1069/13 株，2 株重組病毒的6 個內(nèi)部基因均來源于高度適應雞胚的H1N1 亞型A/Puerto Rico/8/34 株（簡稱為H1N1/PR8）病毒。SPF 雞胚和SPF 雛雞由依托中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所的國家禽類實驗動物資源庫提供。白油、吐溫由哈爾濱維科生物技術有限公司提供。所有涉及H7 亞型AIV 操作的試驗均在生物安全三級實驗室（ABSL-3）進行。

1.2 重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株雞胚內(nèi)增殖和遺傳穩(wěn)定性測定 取重組AIV H7-Re1 株及其HA基因供體株病毒（PG/SHH/S1069/13 株）、重組病毒H7-Re2 株及其HA 基因供體株病毒（CK/GX/SD098/17株），將4 種病毒分別以104倍稀釋后各接種20 枚10日齡SPF 雞胚，0.1 mL/枚，36 ℃培養(yǎng)至96 h，每間隔24 h 照胚一次，觀察雞胚存活情況，同時收獲5枚接種雞胚進行HA 效價檢測。收獲的HA 效價最高時的雞胚尿囊液，按常規(guī)方法分別測定兩株病毒的雞胚半數(shù)感染量（EID50），分裝后于-70 ℃以下保存；同時，根據(jù)獸用生物制品菌/毒種研究要求，將收獲的H7-Re1 株和H7-Re2 株在雞胚中連續(xù)傳代13次后，檢測其對雞胚的致病性、HA 效價和HA 基因裂解位點氨基酸序列。

1.3 重組AIV H7-Re1株和H7-Re2株的致病性試驗

1.3.1 靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)（IVPI）測定 將1.2 中收獲的重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株雞胚尿囊液（HA 效價為9 log2）分別10 倍稀釋后，分別0.1 mL/只靜脈內(nèi)接種6 周齡SPF 雞10 只，記錄接種后10 d 內(nèi)的臨床情況，評定其IVPI。

1.3.2 對雛雞的致病性試驗 取重組AIV H7-Re1 株及親本H7N9 亞型AIV（PG/SHH/S1069/13 株）、重組AIV H7-Re2 株及親本H7N9 亞型AIV（CK/GX/SD098/17 株），分別以106.0EID50鼻腔接種5 周齡SPF 雞，每組10 只，連續(xù)14 d 觀察各組雞臨床癥狀；同時于接種后第3 d 和第5 d 采集喉頭和泄殖腔拭子，按常規(guī)方法檢測其排毒情況。

1.4 重組H7N9 亞型AIV H7-Re1 株滅活疫苗的免疫效力試驗

1.4.1 針對H7N9 亞型低致病力AIV 的免疫效力攻毒試驗 將重組AIV H7-Re1 株按照常規(guī)方法制成油乳劑滅活疫苗（制備疫苗前病毒液HA 價為9 log2），以0.3 mL/只的劑量接種3 周齡SPF 雞10 只，設10 只3 周齡SPF 雞接種相同劑量的PBS，作為對照組。接種疫苗后第3 周采血，經(jīng)HI 試驗檢測血清中針對重組H7N9 亞型AIV H7-Re1 株及攻毒病毒株的HI 抗體效價。免疫后3 周時，用低致病力H7N9 亞型AIV（PG/SHH/S1069/13 株）經(jīng)鼻腔感染途徑進行攻毒，攻毒劑量為每只106EID50/0.1 mL，攻毒后連續(xù)觀察14 d，并于攻毒后第3 d 和第5 d 采集喉頭和泄殖腔拭子，按常規(guī)方法檢測排毒情況。

1.4.2 針對H7N9 亞型高致病力AIV 的免疫效力試驗 按照1.4.1 方法，10 只SPF 雞接種疫苗后3 周時，將高致病力H7N9 亞型AIV（CK/GX/SD098/17）株以105EID50/0.1 mL/只的劑量經(jīng)鼻腔感染途徑進行攻毒，攻毒后連續(xù)觀察14 d，并于攻毒后第3 d 和第5 d 采集喉頭和泄殖腔拭子，同法進行排毒檢測。

1.5 重組H7N9 亞型AIV H7-Re2 株滅活疫苗的免疫效力試驗 將重組AIV H7-Re2 株按照常規(guī)方法制成油乳劑滅活疫苗（制備疫苗前病毒液HA 價為9 log2），按照1.4.1方法免疫SPF雞21 d后，以105EID50/0.1 mL/只的劑量，分別利用H7 亞型AIV CK/GX/SD098/17（H7N9）株和DK/FJ/SE0195/18（H7N2）株進行攻毒，參照1.4 進行檢測。

1.6 重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株疫苗免疫后血清與攻毒用病毒株的反應性比較 收集重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株疫苗免疫后各組雞血清，分別與攻毒病毒株及相關病毒株進行HI 試驗，比較2個疫苗株血清與相關病毒株的反應性。

2 結 果

2.1 2 株重組病毒雞胚內(nèi)增殖和遺傳穩(wěn)定性檢測結果 重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株及PG/SHH/S1069/13（H7N9）株接種雞胚，結果顯示，96 h內(nèi)雞胚全部存活；CK/GX/SD098/17（H7N9）株接種雞胚48 h內(nèi)雞胚全部死亡。重組AIV H7-Re1株和H7-Re2株接種雞胚后的HA 效價檢測，結果顯示，兩株病毒接種72 h 后雞胚尿囊液血凝（HA）效價均達到9 log2，不同時間點兩株病毒HA 效價均明顯高于HA 基因供體病毒（圖1）。測定收獲的H7-Re1 株和H7-Re2 株病毒的EID50，結果顯示其分別為108.14EID50/0.1 mL 和108.31EID50/0.1 mL。使用SPF 雞胚將2 株重組病毒各進行13 代次傳代，結果顯示，各代次病毒接種雞胚后全部存活，接種72 h 時HA 效價均穩(wěn)定在9 log2。HA 基因裂解位點氨基酸序列均為-PKGR↓GLF-，符合低致病力H7 亞型AIV HA 基因分子特征。以上結果表明，重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株在雞胚中具有良好的生長特性，保持雞胚無致病力特征，并具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2 致病力試驗結果

2.2.1 IVPI 測定 2 株重組病毒的IVPI 測定結果顯示，接種重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株的SPF雞，在10 d 觀察期內(nèi)均無任何不良癥狀，經(jīng)計算2株重組病毒的IVPI 值均為0。表明重組AIV H7-Re1株和H7-Re2 株均為低致病力病毒株。

2.2.2 對雛雞的致病性試驗 將4 株病毒以106EID50的劑量鼻腔內(nèi)接種SPF 雞后，結果顯示，CK/GX/SD098/17（H7N9）株接種組雞在接種后5 d 內(nèi)全部發(fā)病死亡，重組AIV H7-Re1 株、H7-Re2 株以及PG/SHH/S1069/13（H7N9）株接種組雞在接種后14 d 內(nèi)均無臨床癥狀。通過HA 試驗檢測接種后第3 d 和第5 d 拭子樣品，結果顯示，PG/SHH/S1069/13（H7N9）和CK/GX/SD098/17（H7N9）接種組雞所有喉頭拭子樣品和部分泄殖腔拭子樣品中均檢測到病毒；而重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株接種雞的喉頭和泄殖腔樣品均未檢測到排毒（表1）。上述結果表明，重組病毒H7-Re1 株和H7-Re2 株均對雞無致病力，而且感染雞不排毒，具有高度的生物安全性。

2.3 重組AIV H7-Re1 株滅活疫苗的免疫效力試驗結果

2.3.1 HI 抗體檢測 SPF 雞接種重組AIV H7-Re1 株滅活疫苗后3 周，進行HI 抗體效價檢測。結果顯示，2 組疫苗免疫雞針對H7-Re1 株的HI 平均抗體效價分別為8.5 log2 和8.0 log2，針對攻毒病毒株PG/SHH/S1069/13（H7N9）和CK/GX/SD098/17（H7N9）的HI 平均抗體效價分別為8.2 log2 和7.2 log2；而對照組雞針對重組AIV H7-Re1 株和攻毒病毒株的HI 抗體均為陰性。表明重組AIV H7-Re1 株滅活疫苗免疫雞后可誘導良好的HI 抗體效價，具有良好的免疫原性。

圖1 2 株重組H7N9 亞型AIV 接種雞胚后不同時間收獲病毒的HA 效價測定結果Fig.1 HA titers of two ressortant H7N9 AIV harvested at different timepointspost inoculation in SPF eggs

表1 H7N9 亞型AIV 分離株和重組病毒株對SPF 雞的致病力Table 1 Pathogenicity of H7N9 avian influenza viruses isolates and reassortant strains in SPF chickens

2.3.2 攻毒保護性試驗 在14 d 觀察期內(nèi)，觀察試驗雞發(fā)病死亡情況，并檢測其排毒結果。結果顯示，攻擊PG/SHH/S1069/13（H7N9）株對照組雞全部存活，但10/10 排毒，攻擊CK/GX/SD098/17（H7N9）株的對照組雞在攻毒后4 d 內(nèi)全部發(fā)病、死亡，喉頭拭子和泄殖腔拭子樣品病毒分離呈陽性；免疫雞均全部存活，無任何臨床癥狀，并且攻毒后第3 d和第5 d 喉頭及泄殖腔病毒分離均為陰性（表2）。表明重組AIV H7-Re1 株制備的滅活疫苗能夠抵御不同致病力H7N9 亞型AIV 的攻擊。

2.4 重組AIV H7-Re2 株滅活疫苗免疫效力檢測結果

2.4.1 HI 抗體檢測 SPF 雞接種重組AIV H7-Re2 株滅活疫苗后3 周時，進行HI 抗體效價檢測。結果顯示，2 組疫苗免疫雞針對重組AIV H7-Re2 株的HI 平均抗體效價分別為8.0 log2 和8.3 log2，針對攻毒用病毒株CK/GX/SD098/17（H7N9）和DK/FJ/SE0195/18（H7N2）的HI 平均抗體效價分別為7.8 log2 和7.5 log2；而對照組雞針對重組病毒株和攻毒病毒株的HI 抗體均為陰性。表明重組AIV H7-Re2 株疫苗免疫雞后可誘導良好的HI 抗體效價，具有良好的免疫原性。

2.4.2 攻毒保護性試驗 攻擊H7 亞型AIV CK/GX/SD098/17（H7N9）株 和DK/FJ/SE0195/18（H7N2）株后，觀察試驗雞發(fā)病死亡情況，并檢測其排毒結果。結果顯示14 d 觀察期內(nèi)，2 組對照雞全部發(fā)病、死亡，而2 組疫苗免疫組雞均無任何臨床癥狀，全部存活。各組雞免疫后第3 d 和第5 d 喉頭拭子和泄殖腔拭子樣品檢測結果顯示，對照組雞病毒分離均呈陽性，2 組疫苗免疫組雞病毒分離均為陰性（表3）。表明重組AIV H7-Re2 株制備的滅活疫苗能夠抵御H7N9 亞型和H7N2 亞型AIV 的攻擊。

表2 重組AIV H7-Re1 株滅活疫苗對2 株H7N9 亞型AIV 的免疫保護性試驗Table 2 Protective efficacy of the H7-Re1 inactivated vaccine against two H7N9 AIVs in SPF chickens

表3 重組AIV H7-Re2 株滅活疫苗對H7N9 亞型和H7N2 亞型AIV 的免疫保護性試驗Table 3 Protective efficacy of the H7-Re2 inactivated vaccine against H7N9 and H7N2 AIVs in SPF chickens

2.5 重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株疫苗免疫后血清與攻毒用病毒株的反應性比較結果 采用HI 試驗檢測重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株疫苗免疫后血清與攻毒病毒株的反應性，結果顯示，重組AIV H7-Re1 和H7-Re2 株免疫后血清用重組病毒株抗原檢測HI 抗體效價均為8 log2，2 種血清與PG/SHH/S1069/13（H7N9）株、CK/GX/SD098/17（H7N9）株 和DK/FJ/SE0195/18（H7N2）株均有較好的HI 抗體反應（≥6 log2），而重組AIV H7-Re2 株血清與流行病學監(jiān)測中分離到的3 株H7 亞型AIV 的HI 抗體反應相對更高（≥7 log2）（表4）。表明H7-Re2 株病毒與2017 年～2018 年分 離的H7 亞 型AIV 抗原性更接 近。

表4 重組AIV 免疫血清與不同H7 亞型AIV 的反應性Table 4 HI cross reaction titers to different H7 AIVs

3 討 論

理想的禽流感滅活疫苗種毒株應具備高滴度雞胚適應性、抗原針對性和高度生物安全性。滿足這3 個必要條件的種毒才能保證生產(chǎn)的疫苗安全、有效、成本經(jīng)濟。

H1N1/PR8 病毒是高度適應雞胚的流感病毒，以H1N1/PR8 病毒為內(nèi)部基因，經(jīng)反向遺傳學構建的疫苗株均具有良好的雞胚適應性。WHO 推薦的季節(jié)性人用流感疫苗株內(nèi)部基因均來自H1N1/PR8，適合接種雞胚來生產(chǎn)流感疫苗。H5N1 亞型重組病毒Re-1株是以我國最早分離的高致病力H5N1 亞型AIV（GS/GD/1/96）為HA 和NA 基因供體，并刪除HA 裂解位點中決定病毒致病力的多個堿性氨基酸，以H1N1（PR8 株）病毒作為內(nèi)部基因供體而構建的重組病毒，接種雞胚后不致死雞胚，抗原含量高，解決了高致病力AIV 無法作為種毒生產(chǎn)疫苗的技術瓶頸[7]。H5 亞型AIV 在自然界進化為多個HA 分支（0～9），其抗原性也發(fā)生了變異。國家禽流感參考實驗室根據(jù)我國不同時期流行病毒的抗原性，先后研制出H5亞型重組病毒Re-4 株（7.2 分支）、Re-5 株（2.3.4 分支）、Re-6 株（2.3.2 分支）、Re-7 株（7.2 分支變異株）、Re-8 株（2.3.4.4 分支）、Re-10 株（2.3.2.1e 分支）、Re-11 株（2.3.4.4d 分支）、Re-12 株（2.3.2.1d 分支）作為滅活疫苗種毒株，用于預防不同時期危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的H5亞型AIV。這些疫苗株內(nèi)部基因均來自H1N1/PR8 病毒，在雞胚中的HA 效價均≥9 log2。除Re-10 株病毒外，這些疫苗株均已推向生產(chǎn)應用[6]。本研究評估的重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株的內(nèi)部基因仍然來自流感病毒H1N1/PR8 株，其接種雞胚后，HA 效價均達到9 log2，并在雞胚中穩(wěn)定遺傳，具有良好的雞胚適應性，適合作為疫苗種毒株，H1N1/PR8 株病毒可作為重組AIV 滅活疫苗種毒的通用內(nèi)部基因供體株。

生物安全性是禽流感疫苗種毒應具備的另一特質(zhì)。H7N9 臨床分離毒株包括低病致力和高致病力病毒株。自然分離的H7N9 低致病力病毒對雞胚和雛雞均無致病性，但其可以在雞體內(nèi)復制和在雞群中有效傳播，因此將其作為疫苗株存在散毒風險。本研究結果顯示，重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2 株對雞胚和雞均無致病性，雛雞感染后無排毒現(xiàn)象。因此，2 株重組病毒均具有良好的生物安全性，適合作為疫苗種毒。

HA 蛋白是AIV 的主要抗原蛋白，含有特定HA基因的疫苗株產(chǎn)生的免疫反應均具有良好的抗原針對性。國家禽流感參考實驗室每年均進行全國性的禽流感病原學監(jiān)測，以充分掌握我國H5、H7 和H9等重要亞型AIV 的流行情況，從分離到的大量病毒株中篩選出優(yōu)勢代表病毒株作為疫苗株的HA 基因供體，進行重組疫苗株的構建。已應用的H5N1 亞型系列重組病毒研制的疫苗對于特定HA 基因供體株所在分支病毒的感染均可提供良好的免疫保護作用[7]。例如，重組AIV H5N1 亞型Re-8 株疫苗可以對H5 亞型2.3.4.4 分支中不同NA 亞型的AIV 感染提供完全免疫保護[8-9]。本研究中的重組AIV H7-Re1株的HA 基因來源于2013 年的低致病力H7N9 亞型AIV（PG/SHH/S1069/13 株），該病毒株制備的疫苗可有效預防低致病力H7N9 亞型AIV 的感染，以該種毒研制的滅活疫苗于2014 年9 月通過農(nóng)業(yè)部新獸藥評價，作為儲備疫苗。2017 年初，我國出現(xiàn)高致病力H7N9 亞型AIV 后，本研究團隊及時對重組AIV H7-Re1 株滅活疫苗進行免疫效力檢測，發(fā)現(xiàn)該疫苗也可以對高致病力H7N9 亞型AIV 攻擊均具有良好的預防效果，以重組AIV H7-Re1 株為種毒研制的重組AIV（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8 株+H7N9 H7-Re1 株）于2017 年9 月開始緊急在我國家禽中大規(guī)模應用，顯著降低了家禽中H7N9 亞型AIV的分離率，并快速阻斷了H7N9 亞型AIV 由禽向人的傳播[5,10-11]。2017 年，國家禽流感參考實驗室又構建出以2017 年分離的高致病力H7N9 亞型AIV（CK/GX/SD098/17）為HA 基因供體的H7-Re2 株疫苗株（HA 裂解位點進行刪除修飾）。與重組AIV H7-Re1株相比，該重組病毒與2017 年～2018 年分離到的H7N9、H7N2 病毒具有更好的抗原匹配性，以重組AIV H7-Re2 株為基礎研制的重組AIV（H5+H7）三價滅活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re2株）替代H7-Re1 株為基礎的重組AIV（H5+H7）二價滅活疫苗，于2019 年初開始在我國家禽中廣泛應用。這些具有抗原針對性的H7N9 亞型禽流感系列疫苗在家禽中應用至今，我國已超過2 年未再出現(xiàn)人的H7N9 疫情。

本研究對構建的重組AIV H7-Re1 株和H7-Re2株的生物學特性和免疫原性進行了系統(tǒng)研究，表明2 株病毒適合作為我國H7N9 防控的疫苗種毒株，為我國H7N9 亞型禽流感滅活疫苗的研制和應用提供實驗依據(jù)。