朱巧艷，張國良，翟路峰，金云云，賀 筍，宋國亮，李俊輝，焦金波，王尊寶，廖永洪*，田克恭*

（1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000；3.天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011;4.洛陽惠中生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽 471000）

豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）和豬肺炎支原體（Mycoplasma Hyopneumoniae，Mhp）作為斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-weaning multi?systemic wasting syndrome，PMWS）和豬呼吸道綜合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）兩大重要的原發(fā)病原，給全球養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重影響[1]。豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種以高熱稽留和廣泛性出血為主要特征的高度傳染性疾病，為國家一類動物疫病，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)[2]。臨床上常以疫苗免疫作為主要防控措施[1-3]，對于PCV2疫苗和CSF 疫苗的免疫已被列入豬場的常規(guī)免疫計劃。由于豬場疫病復(fù)雜，在實際生產(chǎn)中大多通過疫苗接種使得豬群得到保護(hù)，且不同的疫苗按照不同免疫程序分別接種，給豬群造成多次應(yīng)激，對豬群的生長造成影響，同時也增加了人工成本。為了減少豬群應(yīng)激次數(shù)，節(jié)省人工，結(jié)合臨床實際生產(chǎn)，許多學(xué)者對不同疫苗進(jìn)行單獨免疫或同時免疫的效果進(jìn)行研究[4-7]，其中朱子健等提出用PCV2 滅活疫苗作為CSFV 活疫苗的稀釋劑進(jìn)行免疫，均可產(chǎn)生針對兩種病原的免疫抗體，且兩種抗體間互不影響[4]，這些研究為臨床豬場免疫程序優(yōu)化提供了一定的參考依據(jù)。

作為國內(nèi)第一個上市的PCV2-Mhp 二聯(lián)滅活疫苗，一針雙防，給養(yǎng)殖戶帶來便利[8]。為了使疫苗更符合臨床實際應(yīng)用，進(jìn)一步減少豬群應(yīng)激，降低防疫成本，本研究擬用PCV2-Mhp 二聯(lián)滅活疫苗作為稀釋劑稀釋CSF 活疫苗，稀釋后不同時間測定CSFV 活疫苗含量，以及對仔豬免疫后免疫效果進(jìn)行綜合評價，期望達(dá)到能聯(lián)合應(yīng)用的效果，為這3 種病原的疫苗免疫程序優(yōu)化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗、菌毒種、細(xì)胞與實驗動物 水性佐劑PCV2、Mhp 二聯(lián)滅活疫苗（SH 株+HN0613 株），以下簡稱圓支二聯(lián)苗，40 mL/瓶；豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源），以下簡稱CSF 活疫苗，20 頭份/瓶，均由洛陽惠中生物技術(shù)有限公司制備。PCV2 SH 株、Mhp 強(qiáng)毒YC 株和ST 細(xì)胞，均由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心繁殖和保存。14日齡～21日齡健康仔豬45頭，經(jīng)確認(rèn)PCV2 抗 體、Mhp 抗 體、CSFV 抗 體、PCV2 和豬 繁殖與呼吸道綜合征病毒（PRRSV）均為陰性，購自洛陽周邊農(nóng)戶。

1.2 主要試劑 Mhp ELISA 抗體和CSFV ELISA 抗體檢測試劑盒均購自IDEXX 公司；PCV2 ELISA 抗體檢測試劑盒購自荷蘭Biocheck 公司；PCV2 PCR 和PRRSV RT-PCR 檢測試劑盒均購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；豬瘟特異性陽性血清由普萊柯生物工程股份有限公司提供；FITC 標(biāo)記的兔抗豬IgG 購自Sigma公司。

1.3 不同稀釋液稀釋CSF 活疫苗后CSFV 含量測定 將圓支二聯(lián)苗充分搖勻，用注射器抽取5 mL 注入CSFV 活疫苗瓶中完全溶解，輕搖充分混勻。抽取溶解后的混合疫苗注入圓支二聯(lián)苗瓶中，輕搖充分混勻。將充分混勻的混合疫苗分別在室溫（25 ℃）放置0、1 h、2 h 取樣進(jìn)行CSFV 含量測定。同時取CSF 活疫苗用配套稀釋液按同樣方法稀釋，稀釋后CSFV 活疫苗分別在室溫（25 ℃）放置0、1 h、2 h 取樣，用3% α-MEM 維持液作10 倍倍比稀釋，取10-2、10-3、10-43個稀釋度，與ST細(xì)胞同步接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種6 孔，其中稀釋好的樣品0.1 mL/孔，ST 細(xì)胞0.1 mL/孔，同時設(shè)正常ST 細(xì)胞為對照，37 ℃5% CO2，培養(yǎng)觀察72 h，用冷丙酮固定細(xì)胞，以豬瘟特異性陽性血清（1 300）為一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的兔抗豬IgG（1 500）為二抗，采用間接免疫熒光試驗（IFA）測定每個稀釋度含有CSFV 陽性細(xì)胞（呈綠色）的孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench 法計算病毒TCID50。

1.4 動物實驗 將45 頭健康仔豬，隨機(jī)分為9 組，每組5 頭，分組及免疫試驗設(shè)計見表1。其中第1～5組仔豬均頸部肌肉注射圓支二聯(lián)苗，2 mL/頭。首次免疫后14 d 二免，二免時第1～3 組仔豬均頸部肌肉注射圓支二聯(lián)苗和CSF 活疫苗混合疫苗，2 mL/頭；第4、5 組仔豬均頸部肌肉注射圓支二聯(lián)苗，2 mL/頭；第6 組實驗豬于首次免疫后14 d 頸部肌肉注射CSF 活疫苗，2 mL/頭；第7～9 組仔豬不免疫。所有仔豬均于相同條件下隔離飼養(yǎng)。

1.5 PCV2 免疫效力評價 二免后21 d（首免后35 d），第1、4、7組仔豬用PCV2 SH株病毒液（106.0TCID50/mL）參考彭伍平等的攻毒方法攻毒[9]，第9 組實驗豬作為空白對照，既不免疫也不攻毒。攻毒后連續(xù)觀察25 d迫殺，采集肺門淋巴結(jié)或腹股溝淋巴結(jié)，利用免疫組織化學(xué)（IHC）PCV2 抗原檢測，根據(jù)體溫、平均相對日增重和IHC PCV2 抗原檢測結(jié)果進(jìn)行結(jié)果判定。仔豬發(fā)病判定指標(biāo)如下：a、體溫升高（≥40 ℃），持續(xù)3 d 以上；b、免疫組仔豬平均相對日增重高于攻毒對照組（p<0.05），相對日增重=（攻毒后第25 d 體重-攻毒首日體重）÷25÷攻毒首日體重，免疫組與空白對照組間平均相對日增重差異顯著即判為發(fā)?。籧、IHC檢測淋巴結(jié)PCV2 抗原；上述3 項指標(biāo)符合任意2 項即判定為發(fā)病?？瞻讓φ战M仔豬應(yīng)全部正常，攻毒對照組至少4頭發(fā)病，疫苗免疫組至少4頭正常。

表1 動物分組及試驗設(shè)計Table 1 Animal grouping and experimental design

1.6 Mhp 免疫效力評價 二免后28 d（首免后42 d），第2、5、8 組仔豬用Mhp 強(qiáng)毒攻毒，每頭氣管注射10 mL，含100 個最小發(fā)病劑量（MID）。攻毒后28 d 迫殺仔豬，取出肺臟，按28 分法對仔豬的氣喘病肺病變（肉樣變、胰樣變）進(jìn)行評分[10]，計算肺炎病變減少率。肺炎病變減少率=（攻毒對照組仔豬肺炎病變平均得分-免疫組仔豬肺炎病變平均得分）/攻毒對照組仔豬肺炎病變平均得分×100%。

1.7 CSFV 抗體監(jiān)測 第3、6 組仔豬分別在混合疫苗和CSF 活疫苗免疫前、免疫后2、3、4、6、8 周采血，共6 個時間點；分離血清后利用CSFV ELISA 抗體檢測試劑盒檢測血清中的CSFV 抗體，按照說明書標(biāo)準(zhǔn)，CSFV阻斷率≥40%判為抗體陽性。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 利用SPSS21 軟件對仔豬平均相對日增重數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，p<0.05 表示差異顯著，p>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 CSFV 含量測定結(jié)果 經(jīng)不同稀釋液稀釋的混合疫苗和CSF 活疫苗分別在室溫（25 ℃）放置0、1 h、2 h取樣測定CSFV含量。結(jié)果顯示，混合疫苗和CSF 活疫苗放置2 h 內(nèi)CSFV 含量未見下降（表2），表明圓支二聯(lián)苗作為稀釋劑稀釋CSFV 活疫苗CSFV 含量不受影響。

2.2 PCV2 免疫效力評價結(jié)果 PCV2 攻毒后第25 d進(jìn)行結(jié)果判定，結(jié)果混合疫苗、圓支二聯(lián)苗對仔豬的免疫保護(hù)率均為80%，詳細(xì)結(jié)果見表3。表明圓支二聯(lián)苗稀釋CSF 活疫苗后，CSF 活疫苗不影響圓支二聯(lián)苗PCV2的免疫效力。

表2 CSFV 含量測定結(jié)果Table 2 The results of CSFV titers determination

表3 PCV2 免疫效力評價結(jié)果Table 3 The results of PCV2 efficacy evaluation

2.3 Mhp 免疫效力評價結(jié)果 Mhp 攻毒后第28 d 對仔豬迫殺，取出肺臟，按28 分法對試驗豬的氣喘病肺病變（肉樣變、胰樣變）進(jìn)行評分，計算肺炎病變減少率。結(jié)果顯示，混合疫苗、圓支二聯(lián)苗的肺炎病變減少率分別為73.1%、75.0%（表4）。表明圓支二聯(lián)苗稀釋CSF 活疫苗后，CSF 活疫苗不影響圓支二聯(lián)苗Mhp的免疫效力。

2.4 CSFV 抗體監(jiān)測 利用CSFV ELISA 抗體檢測試劑盒檢測圓支二聯(lián)苗+混合疫苗組（第3組）和CSFV 活疫苗組（第6 組）不同時間點采集的血清中CSFV 抗體。結(jié)果顯示，兩個免疫組在混合疫苗和CSFV 活疫苗首次免后3 周所有仔豬CSFV 抗體均陽轉(zhuǎn)，在混合疫苗和CSF 活疫苗首次免疫后6 周CSFV 抗體達(dá)到峰值（圖1）。表明圓支二聯(lián)苗稀釋CSF 活疫苗而成的混合疫苗免疫一次與CSF 活疫苗免疫一次均能夠刺激仔豬產(chǎn)生良好的CSFV抗體水平。

表4 Mhp 免疫效力評價結(jié)果Table 4 The results of Mhp efficacy evaluation

圖1 免疫豬血清中CSFV 抗體檢測結(jié)果Fig. 1 The results of CSFV antibody detection in serum

3 討 論

有報道稱PCV2 感染可以造成豬免疫系統(tǒng)損害，從而抑制豬免疫應(yīng)答產(chǎn)生，影響CSF 疫苗免疫時抗體的產(chǎn)生[11-12]，作為危害養(yǎng)殖業(yè)的兩大病原，臨床上早已把CSF 疫苗和PCV2 疫苗納入到豬場常規(guī)免疫程序中。Mhp 作為PRDC 主要原發(fā)病病原之一，給豬場帶來的經(jīng)濟(jì)損失也不容忽視，越來越多的豬場開始重視Mhp 疫苗的免疫。針對這3 種病原，早期免疫程序中至少需要免疫3 種單苗才可達(dá)到預(yù)防疫病的目的，隨著圓支二聯(lián)苗上市，免疫圓支二聯(lián)苗和CSF 活疫苗2種疫苗即可達(dá)到相同目的，但是免疫程序仍有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。

本研究為了進(jìn)一步優(yōu)化豬群免疫程序，降低豬群免疫應(yīng)激次數(shù)，盡可能降低防疫成本，本研究使用的圓支二聯(lián)苗是水性佐劑，疫苗本身能夠作為稀釋劑稀釋CSF活疫苗，在室溫放置2 h監(jiān)測CSFV 含量未見下降，疫苗混合后2 h 內(nèi)CSFV 含量不受影響，這樣可以給臨床疫苗混合使用提供時間保證。

為了在仔豬上評價圓支二聯(lián)苗和CSF 活疫苗混合使用效果，本實驗通過篩選獲得PCV2 抗體、Mhp 抗體、CSFV 抗體、PCV2 病原和PRRSV 病原均為陰性的健康仔豬，在排除可能影響疫苗效果的外源病原干擾的情況下進(jìn)行混合疫苗的免疫效果評價。其中PCV2 和Mhp 的免疫效力，均采用免疫攻毒方法進(jìn)行評價，結(jié)果圓支二聯(lián)苗和CSFV 活疫苗混合使用的效果與圓支二聯(lián)苗單獨使用的效果相當(dāng)，均能針對PCV2和Mhp感染產(chǎn)生較好的攻毒保護(hù)效果；對于CS?FV 的免疫效力，采用CSFV 抗體監(jiān)測的方法進(jìn)行評價，結(jié)果圓支二聯(lián)苗和CSF 活疫苗混合使用和CSF 活疫苗單獨使用均能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較好的CSFV 抗體水平，兩者免疫效果相當(dāng)。

本研究結(jié)果表明圓支二聯(lián)苗可以作為稀釋劑稀釋CSF 活疫苗，一次性注射免疫后疫苗各自免疫效力均不受影響，從而為圓支二聯(lián)疫苗稀釋CSF 活疫苗的聯(lián)合應(yīng)用方式提供實驗依據(jù)，為其臨床推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。