洪建明，占景華，蔡明勇

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院普通外科，福建 漳州 363000)

胃癌居全球惡性腫瘤相關(guān)死亡原因第2位，占全部惡性腫瘤死亡的10.4%[1]，在我國其發(fā)病率也呈上升趨勢。近年來，免疫治療作為一種通過激活機(jī)體免疫系統(tǒng)來特異性清除腫瘤細(xì)胞的新方法正逐步應(yīng)用到胃癌的治療中。腫瘤研究領(lǐng)域的學(xué)者越來越多把目光集中在免疫治療上，但是如今的免疫治療也存在諸多問題[2]。生存素作為凋亡蛋白家族抑制劑的成員之一，在人類許多種惡性腫瘤中過表達(dá)，陽性表達(dá)的生存素與分化相關(guān)，通過核糖核酸干擾后可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖和遷移降低[3]。更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，生存素導(dǎo)致細(xì)胞周期靜止，這表明生存素在胃癌中起重要作用，并且使用生存素沉默核糖核酸可能成為惡性腫瘤治療的有效方法[4]。至今，已有很多學(xué)者利用生存素及其異構(gòu)體的表位作為基礎(chǔ)載體研究出不同的基因疫苗或肽疫苗，并在抗腫瘤中取得成果，故我們通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法將胃泌素抗原表位-生存素抗原表位基因及類熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)蛋白基因連接在原核表達(dá)載體中，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)胃泌素-生存素-熱休克蛋白(Gas-Sur-Hsp70L1)融合蛋白。我們通過Western Blot法鑒定Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的性質(zhì)，應(yīng)用體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)的動物實(shí)驗(yàn)了解Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的免疫激活活性以及對小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的影響。

1 資料與方法

1.1 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白和相關(guān)對照蛋白的原核表達(dá)與純化從高胃泌素血癥患者胃竇組織樣品中克隆胃泌素互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)全長，以此為模板PCR擴(kuò)增編碼前胃液素第1～14位氨基酸殘基組成的編碼片段；從胃癌患者胃組織樣品中克隆生存素cDNA全長，以此為模板PCR擴(kuò)增編碼生存素第32～54位氨基酸殘基組成的編碼片段；從健康志愿者外周血細(xì)胞培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞中克隆HSP cDNA全長。

通過酶切連接構(gòu)建pET28a-Hsp70L1、pET28a-Gas1-14-Hsp70L1、pET28a-Sur32-54-Hsp70L1、pET28a-Gas1-14-Sur32-54-Hsp70L1質(zhì)粒。重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在LB培養(yǎng)基中用異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，Western Blot法檢測表達(dá)蛋白；表達(dá)蛋白的N端均帶有6×His標(biāo)簽，包涵體蛋白通過變性、復(fù)性；依次用Ni+金屬離子鰲合層析、離子交換層析進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物透析至磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中凍存待用；銀染SDS-PAGE分析融合蛋白純度；鱟試劑測定法分析細(xì)菌脂多糖污染。

1.2 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白對樹突狀細(xì)胞成熟的促進(jìn)作用研究將培養(yǎng)第7天的小鼠非成熟樹突狀細(xì)胞，經(jīng)10 μg/mL Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白作用48 h后，流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)胞表型：樹突狀細(xì)胞表面CD40、CD80、CD86、Iab等表面分子的表達(dá)情況。

1.3 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性研究在C57BL/6小鼠近尾根部右側(cè)背下部皮下肌注胃癌細(xì)胞，接種成功標(biāo)準(zhǔn)為注射局部出現(xiàn)直徑7 mm左右的皮丘。實(shí)驗(yàn)分組：將50只帶瘤小鼠隨機(jī)均分為5組，每組10只小鼠。1)空白對照組：接種腫瘤后不予任何處理；2)陰性對照組：第1、4、7、14天在小鼠后腿部近淋巴結(jié)處皮下注射200 μL的PBS；3)1 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組：第1、4、7、14天于小鼠后腿部靠近淋巴結(jié)處皮下注射200 μL的5 g/L Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白；4) 10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組：第1、4、7、14天于小鼠后腿部靠近淋巴結(jié)處皮下注射Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白200 μL的50 g/L Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白；5) 100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組：第1、4、7、14天于小鼠后腿部靠近淋巴結(jié)處皮下注射Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白200 μL的500 g/L Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白，給藥后每3 d測量腫瘤體積。腫瘤體積按公式V=1/2ab2(a=瘤長，b=瘤寬)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的鑒定Western Blot結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)所得Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白與抗生存素單克隆抗體結(jié)合。生存素的特異性在Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白中同樣存在。

2.2 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白對人樹突狀細(xì)胞表面CD86表達(dá)的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測提示通過引入Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白后我們觀察到樹突狀細(xì)胞表面CD86分子得到明顯表達(dá)，表達(dá)上調(diào)達(dá)到52.93%，這與對照細(xì)胞明顯不同，說明該融合蛋白能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的活化成熟與表達(dá)。結(jié)果還顯示，融合蛋白中的脂多糖雜質(zhì)也可以促進(jìn)CD86分子的表達(dá)，表達(dá)上調(diào)率為27.77%。上述對比提示Gas-Sur-Hsp70L1蛋白對CD86分子的上調(diào)起主要作用，前者比后者多38.60%。

2.3 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性陰性對照組、空白對照組、1 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組、10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組、100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組腫瘤體積分別為(12.67±6.31)、(14.39±6.47)、(12.16±4.81)、(4.94±5.51)、(6.64±3.81)cm3。10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組、100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組腫瘤體積均高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)。1、10、100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白均可以抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長，抑制率分別為0.04%、61.01%、47.59%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白具有最明顯有效抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長的作用。

3 討論

在眾多實(shí)驗(yàn)中外源性腫瘤抗原通常只能通過體內(nèi)免疫誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，然而細(xì)胞免疫反應(yīng)在腫瘤免疫中起主要作用[5-6]。因此，大多數(shù)腫瘤免疫領(lǐng)域的學(xué)者致力于尋找探索一種有效的方法或介質(zhì)可以把外源性腫瘤抗原或肽疫苗引入到細(xì)胞免疫途徑中。許多研究[7]表明，外源性主要組織相容性復(fù)合體-I(major histocompatibility complex-I，MHC-I)類腫瘤抗原表位可以通過HSP將其引導(dǎo)入細(xì)胞免疫中并發(fā)揮作用，激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞攻擊、殺滅相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中連接HSP70L1和生存素的部分MHC-I類抗原表位制成融合蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體進(jìn)行抗腫瘤免疫作用。

本實(shí)驗(yàn)我們通過從人的濃縮白細(xì)胞中提取未成熟的樹突狀細(xì)胞，并在體外用Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白作用于此樹突狀細(xì)胞,通過檢測樹突狀細(xì)胞表面分子CD86的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在促進(jìn)樹突狀細(xì)胞表面分子CD86的表達(dá)方面起主要作用。這提示Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白對于樹突狀細(xì)胞的成熟起著促進(jìn)作用，從而起著抗腫瘤免疫的作用。負(fù)載不同劑量Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的樹突狀細(xì)胞注射荷瘤小鼠后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，劑量為10 μg的Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白對小鼠的腫瘤生長的抑制作用最明顯。這提示并不是Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白劑量越大抑瘤效果越好，最佳抑制腫瘤生長的劑量還需進(jìn)一步研究。

如今腫瘤抗原的選擇是抗腫瘤免疫研究的熱點(diǎn)之一，將外源性腫瘤抗原引入細(xì)胞免疫途徑成為關(guān)鍵步驟[8]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成了一種Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白，發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞活化、成熟等。我們還發(fā)現(xiàn)Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了特異性的抗腫瘤作用，目前已經(jīng)有研究證實(shí)Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白用于腫瘤的免疫治療是可行的[9]。我們也初步發(fā)現(xiàn)并證明了Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的免疫激活作用和抗腫瘤作用[10-12]?？傊?，Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白可能具有一定的抗腫瘤活性。