劉麗娜，傅曼琴，徐玉娟，吳繼軍，余元善，溫 靖

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524000）

【研究意義】陳皮（Pericarpium Citri Reticulatae,PCR）為蕓香科植物橘（Citrus reticulateBlanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮［1］，為廣東道地藥材，位列廣東三寶之首?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（一部，2005版）收載的陳皮藥材［2］分為陳皮和廣陳皮，其自古即有“陳久者良”的說(shuō)法，具有行氣、調(diào)中、燥濕化痰等功效［3-4］。其中廣陳皮（新會(huì)陳皮）因其質(zhì)優(yōu)而獨(dú)具地道藥材的特色［5］，具有很高的市場(chǎng)價(jià)值。陳皮中含有揮發(fā)性成分，其揮發(fā)油直接作用于腸道平滑肌，可降低正常家兔腸道收縮頻率［6］，對(duì)氣管平滑肌有抑制［7］、抗氧化作用［8］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】以往對(duì)陳皮揮發(fā)性成分的研究大部分采用提取揮發(fā)油的方法［9］。陳彤等［10］采用GC-MS建立8個(gè)不同產(chǎn)地22種陳皮揮發(fā)油的指紋圖譜，結(jié)果表明，22種陳皮揮發(fā)油的相似度在0.886～1之間，其中4個(gè)地區(qū)的樣品獲得了良好區(qū)分，而來(lái)自廣東云浮、廣西梧州和廣東清遠(yuǎn)3個(gè)產(chǎn)地的樣品聚成一類(lèi)，最終確定共有峰中左旋-α-蒎烯、α-法尼烯、β-蒎烯和微量組分中的大根香葉烯為顯著貢獻(xiàn)的主成分組分。裴亞萍［11］用GC-MS法分析以水和食用乙醇作為溶劑制備的陳皮提取物的揮發(fā)性香氣成分，并與水蒸汽蒸餾法萃取的陳皮天然揮發(fā)性香成分進(jìn)行成分比對(duì)，結(jié)果表明：3種樣品經(jīng)GC-MS分別檢測(cè)出17種（陳皮水提取物）、13種（皮乙醇提取物）和9種（陳皮天然香成分）揮發(fā)性香氣成分，3種樣品中含有的主要揮發(fā)性成分均為糠醛、d-苧烯和α-松油醇。楊元豐等［12］采用主成分分析（PCA）和聚類(lèi)分析對(duì)《中華人民共和國(guó)藥典》中4個(gè)品種來(lái)源的陳皮揮發(fā)油GC-MS數(shù)據(jù)分析比較，通過(guò)主成分分析和聚類(lèi)分析可將廣東新會(huì)茶枝柑樣品與其他樣品大致分為兩類(lèi)。夏倫祝等［13］采用超臨界CO2流體萃取法提取10批陳皮樣品的脂溶性成分，采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析陳皮脂溶性成分中的特征成分，結(jié)果表明，10批樣品中含有右旋檸檬烯、α-羅勒烯、α-吡喃酮、α-蓽澄茄烯、反式-石竹烯等27種共有成分，其保留時(shí)間和峰面積形成了特征性指紋圖譜。周欣等［14］用GC-MS方法分析不同年份新會(huì)陳皮揮發(fā)油的成分和含量，結(jié)果表明，隨著年份增長(zhǎng)，新會(huì)陳皮揮發(fā)油成分含量在3年內(nèi)隨著時(shí)間增長(zhǎng)而增加，甚至出現(xiàn)一些新的成分?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以往研究多采用提取陳皮揮發(fā)油結(jié)合GC-MS分析研究陳皮揮發(fā)性成分，對(duì)不同產(chǎn)地、不同來(lái)源的陳皮揮發(fā)油主成分以及特征香氣成分進(jìn)行分析并建立指紋圖譜，但并未對(duì)檢測(cè)到的陳皮揮發(fā)性成分全面說(shuō)明，也未分析不同貯藏年份陳皮中揮發(fā)性成分的差異。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用頂空固相微萃?。℉SSPME）結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）的方法對(duì)貯藏時(shí)間分別為1年（2017年）、5年（2013年）、15年（2003年）的新會(huì)陳皮樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，明確不同貯藏時(shí)間陳皮揮發(fā)性成分的差異，為陳皮的品質(zhì)鑒定及調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017年、2013年、2003年產(chǎn)陳皮均購(gòu)于江門(mén)市新寶堂陳皮有限公司，陳皮來(lái)源于同一果園當(dāng)年12月份所采茶枝柑的成熟果皮，經(jīng)同一方法陳化制得。

儀器設(shè)備：ME204分析天平（瑞士METTLER公司）、RHP-100 高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司）、HWS-26 電熱恒溫水浴鍋（上海恒科學(xué)儀器有限公司）、YH系列電熱器（江蘇近湖鎮(zhèn)教學(xué)儀器廠(chǎng)）、GC-MS 6980N/5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）、手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、50/30μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭（美國(guó)Supelco公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 陳皮中揮發(fā)性成分測(cè)定采用張浩［15］方法，加以修改。先將陳皮剪碎，用打粉機(jī)輕微打成粉狀，打粉5 s后立即停止，避免高溫破壞陳皮香氣物質(zhì)。稱(chēng)量0.50 g陳皮粉末于固相微萃取樣品瓶中，加入5 mL蒸餾水浸泡20 min。

1.2.2 HS-SPME法 萃取頭活化：250℃條件下，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭置于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口活化30 min左右，直至色譜檢測(cè)無(wú)干擾峰出現(xiàn)。HS-SPME：在待測(cè)樣品加入磁性攪拌子于65℃恒溫水浴，調(diào)整轉(zhuǎn)速為150 r/min，在電熱恒溫加熱攪拌器中平衡10 min，再將活化好的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，65℃條件下吸附30 min，最后將吸附好分析組分的萃取頭拔出并插入GC-MS進(jìn)樣器中解吸。

1.2.3 色譜條件 Agilent6890N氣相-色譜儀，色譜柱型號(hào)：DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：He，流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL，分流進(jìn)樣20∶1，進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序：起始柱溫40℃，以10℃/min的速率升溫到70℃，然后以3℃/min的速率升溫到190℃，再以10℃/min的速率升溫到220℃。

1.2.4 質(zhì)譜條件 Agilent5975B MSD質(zhì)譜，電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，全程掃描范圍m/z 40-500 AMU/sec。

1.2.5 揮發(fā)性成分測(cè)定 經(jīng)頂空固相微萃取后，拔出萃取頭，立即置于氣相色譜進(jìn)樣口中解吸5 min，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3 分析方法

1.3.1 定性分析 化合物經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與資料庫(kù)相匹配，選擇較高匹配度的檢索結(jié)果，結(jié)合每個(gè)峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和化合物的質(zhì)譜裂解特征，并結(jié)合參考文獻(xiàn)中報(bào)道的已知化合物確認(rèn)檢測(cè)物成分，對(duì)其進(jìn)行定性分析。

1.3.2 定量分析 單個(gè)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)利用峰面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量，求得各揮發(fā)性化學(xué)組分的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳皮中揮發(fā)性成分

如圖1所示，不同貯藏年份陳皮揮發(fā)性成分的總離子流圖總體差異不顯著，對(duì)其中檢測(cè)到的所有成分進(jìn)行定性檢索，從貯藏年份為2017年、2013年和2003年陳皮中分別檢測(cè)出34種、38種和39種揮發(fā)性成分，將這些化合物按面積歸一化計(jì)算，分別約占總峰面積的 96.78%、99.86%和99.40%。表明隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，陳皮中揮發(fā)性化合物種類(lèi)增加；3個(gè)不同貯藏年份陳皮揮發(fā)性成分都主要包括烯烴類(lèi)、醇類(lèi)、酚類(lèi)、醛類(lèi)和酯類(lèi)化合物，其中D-檸檬烯相對(duì)含量最高，達(dá)50%～65%，隨陳皮貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，其相對(duì)含量逐漸降低，3-蒈烯和γ-松油烯的含量次之，達(dá)12%～21%，隨陳皮貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，3-蒈烯含量逐漸增加，而γ-松油烯的含量逐漸減少（表1）。

進(jìn)一步對(duì)不同貯藏年份陳皮中各揮發(fā)性成分的相對(duì)含量進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)隨著貯藏年限延長(zhǎng)，陳皮揮發(fā)性組分的種類(lèi)及相對(duì)含量發(fā)生顯著性差異，有逐年遞增或遞減的，也有先增后減或先減后增，說(shuō)明不同揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量變化規(guī)律不同。

由表1可知，α-側(cè)柏烯、蒎烯、γ-松油烯、芳樟醇、香茅醛等15種揮發(fā)性化合物相對(duì)含量遞減或消失，如γ-松油烯，2017年陳皮相對(duì)含量為20.10 %，2013年的相對(duì)含量為17.48 %，2003年陳皮中則未檢測(cè)到；揮發(fā)性物質(zhì)含量遞增或產(chǎn)生新的揮發(fā)性物質(zhì)的有β-蒎烯、萜品油烯、香芹酚、β-石竹烯、月桂烯、D-香芹酮、石竹素、棕櫚酸甲酯等18種化合物，且只在2003年陳皮的揮發(fā)性組分中檢測(cè)到月桂烯、百里酚等香氣成分；而某些揮發(fā)性成分只存在于某個(gè)貯藏年份的陳皮中，本研究檢測(cè)到苯類(lèi)及酮類(lèi)化合物只存在于2003年貯藏的陳皮中。

圖1 不同貯藏年份陳皮揮發(fā)性成分總離子流Fig.1 Total ion flow of volatile components of PCR in different storage years

表1 不同貯藏年份陳皮中揮發(fā)性成分及其相對(duì)含量Table 1 Volatile components in PCR in different storage years and their percentages

2.2 陳皮中主要香氣成分

陳皮香氣成分主要是萜烯類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)和酚類(lèi)等多種含氧化合物，特征香氣成分有D-檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、3-蒈烯、γ-松油烯、檸檬烯、N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯、甜橙醛、癸醛、紫蘇醛、α-松油醇等，達(dá)幾十種之多，每種物質(zhì)對(duì)香氣的貢獻(xiàn)大小取決于香氣閾值［16］。在3個(gè)不同貯藏年份的陳皮揮發(fā)性組分中共檢測(cè)到61種化合物（圖2），其中烯烴類(lèi)物質(zhì)28種、占80%以上，是主要揮發(fā)性成分；醇類(lèi)物質(zhì)7種，醛類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)各6種，烷烴類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)各4種，苯和萘類(lèi)物質(zhì)各2種，醚類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)各1種。

圖2 不同貯藏年份陳皮主要香氣成分比較Fig.2 Comparison of main aroma components of PCR in different storage years

2.2.1 烯烴類(lèi) 萜烯類(lèi)化合物是陳皮揮發(fā)性物質(zhì)中的主要成分［17］。烯烴類(lèi)化合物是陳皮揮發(fā)性成分中含量最高的一類(lèi)，在不同貯藏年份陳皮中呈顯著差異性（圖2）。在貯藏年份為2017年、2013年、2003年陳皮中分別檢測(cè)出18、21、18種烯烴類(lèi)物質(zhì)，含量分別為88.42%、94.61%、77.76%。所有烯烴類(lèi)物質(zhì)中均以D-檸檬烯含量最高，分別為60.74%、59.05%、54.4%，3-蒈烯含量次之，分別為1.06%、12.23%、17.01%。亞甲基-1-環(huán)己烯、萜品油烯、β-石竹烯、α-芹子烯、α－法呢烯等5種物質(zhì)在3個(gè)不同年份陳皮中的含量均大于0.1%。

2.2.2 酯類(lèi) 酯類(lèi)物質(zhì)是陳皮揮發(fā)性成分的主要組分，僅次于烯烴類(lèi)物質(zhì)。在貯藏年份為2017年、2013年、2003年陳皮中分別檢測(cè)出3、3、5 種酯類(lèi)物質(zhì)，含量分別為5.93%、3.71%、7.21%。乙酸橙花酯、N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯是3個(gè)不同貯藏年份陳皮中的共有成分，N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯的相對(duì)含量分別為5.86%、3.63%、6.82%，顯著高于其他酯類(lèi)物質(zhì)。乙酸香葉酯、月桂酸甲酯只在2003年的陳皮中檢測(cè)到，且含量均低于1%。

2.2.3 醛類(lèi) 醛類(lèi)物質(zhì)也是陳皮揮發(fā)性成分的主要組分。由圖2可知，隨著貯藏年限延長(zhǎng)，醛類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量越來(lái)越低，種類(lèi)也越來(lái)越少。在貯藏年份為2017年、2013年、2003年陳皮中分別檢測(cè)出6、4、3種醛類(lèi)物質(zhì)，含量分別為1.28%、0.84%、0.49%；其中甜橙醛的相對(duì)含量最高，隨著貯藏年限延長(zhǎng)，其含量先增加后減少；醛類(lèi)物質(zhì)對(duì)陳皮香氣有重要貢獻(xiàn)，特別是甜橙醛具有愉悅香氣，是陳皮精油特征香氣的主要成分［18］。

2.2.4 酚類(lèi)、醇類(lèi)和萘類(lèi) 酚類(lèi)物質(zhì)雖然含量不高，但對(duì)陳皮香氣也有一定貢獻(xiàn)。在貯藏年份為2017年、2013年、2003年的陳皮中共檢出4種酚類(lèi)化合物，香芹酚（0.1%、0.11%、0.18%）和4-異丙基-3-甲酚（0.12%、0.04%、0.17%）是3個(gè)不同貯藏年份陳皮的共有物質(zhì)，且隨著陳皮貯藏年限延長(zhǎng)，香芹酚的相對(duì)含量逐漸增加；在2003年陳皮種還檢測(cè)到百里酚（0.07%）和壬基酚（0.14%）。共檢出7種醇類(lèi)化合物，含量分別為0.77%、0.13%、0.72，由此可知，隨貯藏年限延長(zhǎng)，陳皮中的醇類(lèi)物質(zhì)先減少后增加。芳樟醇只在2017年陳皮中檢測(cè)到（0.24%），4-萜烯醇只在2013年陳皮中檢測(cè)出（0.11%），兩種物質(zhì)的相對(duì)含量均大于0.1%。此外，在3個(gè)不同年份陳皮中均檢測(cè)出（1S,8aR）-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氫萘，含量分別為0.11%、0.2%、0.11%。在2003年陳皮中檢測(cè)到D-香芹酮，含量為0.15%。而烷烴類(lèi)物質(zhì)只在2013年陳皮中檢測(cè)到，相對(duì)含量為0.19%。

從3個(gè)不同貯藏年份陳皮揮發(fā)性成分分析來(lái)看，不同貯藏時(shí)間對(duì)陳皮香氣的影響差異較大，可能與陳皮表面微生物的代謝活動(dòng)有關(guān)［19］，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，陳皮微生物的積累可能發(fā)生變化，從而影響陳皮揮發(fā)性成分組成，進(jìn)而使陳皮的香氣發(fā)生變化。

3 討論

本研究以貯藏時(shí)間為1年（2017年）、5年（2013年）和15年（2003年）陳皮為對(duì)象，分析其揮發(fā)性成分差異，從3個(gè)不同貯藏年份的陳皮中共檢測(cè)出61種化合物，其中貯藏1年、5年和15年陳皮中分別檢測(cè)出34種、38種和39種揮發(fā)性成分，這一結(jié)果相較于提取揮發(fā)油［20］檢測(cè)到的成分多，原因可能是因?yàn)轫斂展滔辔⑤腿?duì)于一些揮發(fā)性組分以及半揮發(fā)性組分靈敏度較好，能得到穩(wěn)定可靠地定性定量結(jié)果；對(duì)于一些含量較低、低揮發(fā)性的組分來(lái)說(shuō)，固相微萃取技術(shù)能有效起到一個(gè)富集的作用。

本研究結(jié)果表明，不同貯藏時(shí)間陳皮中D-檸檬烯相對(duì)含量最高，并隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)其相對(duì)含量會(huì)逐漸降低，邱芷柔等［21］為了最大化獲取陳皮揮發(fā)性成分，采用頂空固相微萃取（HSSPME）結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)不同貯藏年份陳皮進(jìn)行分析，結(jié)果表明，3個(gè)不同貯藏年份陳皮中共檢出44種揮發(fā)性成分，其中含量最高的是陳皮的特征香氣代表D-檸檬烯；Yu等［22］對(duì)陳皮揮發(fā)油進(jìn)行分析，主要成分為D-檸檬烯（5.28%）、1-甲基-4-（1-甲基乙基）-1,4-環(huán)己二烯（7.7%）、β-月桂烯（2.98%）、a，α-4-三甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醇（0.94%）、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（0.87%）和α-蒎烯（0.53%）；Wang等［23］從青皮和陳皮分別檢測(cè)出61、59種化合物，指出青皮和陳皮中D-檸檬烯的含量最高，分別占揮發(fā)油總量的65.61%，83.14%；以上研究結(jié)果與本文研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明陳皮中的主要香氣成分D-檸檬烯的含量最高。此外，Pernice等［24］研究還表明陳皮揮發(fā)油中的主要成分萜烯類(lèi)化合物，具有較強(qiáng)的抗菌和抗氧化活，高蓓［25］研究也發(fā)現(xiàn)，廣陳皮揮發(fā)油對(duì)黃曲霉和漢遜德巴利酵母均有一定抑菌效果，對(duì)黑曲霉無(wú)顯著抑菌效果。

易倫朝等［26］采用GC-MS和HPLC-DAD聯(lián)用技術(shù)，對(duì)不同年份自貢陳皮和“老化”模擬實(shí)驗(yàn)新會(huì)陳皮樣品的揮發(fā)油和黃酮類(lèi)成分進(jìn)行分析，得到高含量的檸檬烯會(huì)使新鮮果皮產(chǎn)生不良?xì)馕叮惼ぶ袡幟氏┑暮恐饾u減少，氣味隨之香醇的結(jié)論，為陳皮“陳久者良”的說(shuō)法找到了一定根據(jù)。本研究通過(guò)HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)不同貯藏時(shí)間陳皮揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，明確陳皮中揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)陳皮貯藏時(shí)間越久，萜烯類(lèi)和醛類(lèi)化合物含量越低，酯類(lèi)、酚類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)含量越高；在陳皮貯藏15年間，D-檸檬烯相對(duì)含量逐漸減少，但均高于50%，這對(duì)研究陳皮陳化品質(zhì)的形成及其調(diào)控具有參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，隨著陳皮貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，陳皮揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)越來(lái)越豐富，烯烴類(lèi)和萘類(lèi)化合物相對(duì)含量先增加后減少，酯類(lèi)、酚類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)含量先減少后增加，醛類(lèi)化合物相對(duì)含量逐年遞減。在陳皮陳化過(guò)程中，某些揮發(fā)性成分會(huì)消失，同時(shí)也會(huì)生成新的物質(zhì)，但依然是萜烯類(lèi)、醛類(lèi)及酯類(lèi)化合物等作為揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分，其中以D-檸檬烯含量占比最大，達(dá)50%～65%。