周 芳，梅 瑜，顧 艷，蔡時(shí)可，王繼華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳與改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】穿心蓮〔Andrographis paniculata（Burm.F.）Nees〕為爵床科（Acanthaceae）穿心蓮屬（Andrographis）1年生草本植物，別名一見喜、苦草、印度草和橄欖蓮等，是我國(guó)常用的大宗中藥材之一，在東南亞國(guó)家也具有悠久的民間用藥歷史［1］。其性味苦、寒，歸心、肺、大腸、膀胱經(jīng)，主要藥用成分為穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯等二萜內(nèi)酯類化合物，具有抗菌消炎、清熱解毒和消腫止痛等功效，臨床多應(yīng)用于呼吸道感染、腸胃炎、糖尿病和高血壓等心血管疾病的治療，被稱為“中藥抗生素”［2-6］。穿心蓮是利膽消炎片、注射液的主要原料，也是重要的中獸藥主要成分，廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，其藥用市場(chǎng)前景廣闊，具有良好的發(fā)展?jié)摿Γ?-10］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前在穿心蓮?fù)蛔凅w創(chuàng)制上主要的誘變技術(shù)包括航天誘變、物理誘變和化學(xué)誘變［11-12］。其中，化學(xué)誘變成本低、操作簡(jiǎn)單，但通過人工方法產(chǎn)生常規(guī)育種中難以獲得新性狀，對(duì)植物品種的定向改良和新種質(zhì)資源的創(chuàng)制具有重要作用，在植物育種和基因功能研究中應(yīng)用廣泛［13-14］。在穿心蓮種子誘變研究中，0.075%秋水仙堿誘導(dǎo)穿心蓮種子24 h，獲得的同源四倍體無(wú)菌苗的上、葉下表皮氣孔特征與二倍體無(wú)菌苗相比均存在顯著性差異［15］。大氣壓等離子體處理穿心蓮種子，可產(chǎn)生突變植株并且突變率和種子的含水量相關(guān)［16］。甲基磺酸乙酯（EMS）是常用的植物化學(xué)誘變劑，具有誘變頻率高、點(diǎn)突變多、變異類型豐富和易操作等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于植物育種和分子生物學(xué)研究［14-17］。EMS誘變技術(shù)在農(nóng)作物上的應(yīng)用較為成熟，在蔬菜、糧食作物和花卉上較多，獲得具有農(nóng)藝和品質(zhì)性狀豐富的突變類型后代群體，如耐濕性甘藍(lán)型油菜突變體［18-19］。【本研究切入點(diǎn)】作為藥用植物，穿心蓮閉花受精的生物學(xué)特性阻礙了群體內(nèi)遺傳多樣性的發(fā)生，種質(zhì)資源遺傳背景較窄，傳統(tǒng)雜交育種相對(duì)受限［20-21］。利用各種基因突變技術(shù)創(chuàng)制新的種質(zhì)資源逐漸受到青睞。目前，EMS誘變技術(shù)在中草藥方面的研究相對(duì)較少，誘導(dǎo)穿心蓮?fù)蛔凅w的研究未見報(bào)道。穿心蓮EMS誘變研究可以豐富誘變育種材料并加快育種進(jìn)程、提升育種水平、創(chuàng)新優(yōu)良品種、保障野生中藥材資源的可持續(xù)利用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過比較分析EMS溶液的不同濃度和處理時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)過程的影響，獲得穿心蓮?fù)蛔凅w庫(kù)建立的最優(yōu)條件，建立穩(wěn)定的穿心蓮EMS誘變技術(shù)；并對(duì)誘變后表型有差異的植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)方面的評(píng)價(jià)與鑒定，獲得突變表型豐富的突變體庫(kù)，為穿心蓮在功能基因組學(xué)方面的研究及新種質(zhì)選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

穿心蓮種子為河北省農(nóng)林科學(xué)院溫春秀研究員提供，為福建漳州生產(chǎn)用種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理 將穿心蓮種子置于1%洗潔精溶液中完全浸泡，超聲波清洗處理60 min。清潔完畢后用自來(lái)水清洗數(shù)遍，再用自來(lái)水浸泡處理12 h，取出用紗布擦干穿心蓮種子表面的水分。將預(yù)處理好的種子放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、0.8%的EMS溶液中，恒溫振蕩培養(yǎng)4、8、12 h。于2019 年10月種植于泥炭土和珍珠巖配比為3∶1的培養(yǎng)土，置于溫度26℃、濕度80%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以未經(jīng)EMS處理的穿心蓮種子萌發(fā)的幼苗為對(duì)照。

1.2.2 種子發(fā)芽與幼苗指標(biāo)調(diào)查 2020年3月，對(duì)植株的表型進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。

株高：穿心蓮種子播后35 d，測(cè)量幼苗株高，每個(gè)處理4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50株，選對(duì)角線5株測(cè)量株高。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用IBM SPSS（Version 19.0）分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用LSD（Least-Significant Difference）最小顯著性差異法進(jìn)行多重比較，該方法由英國(guó)統(tǒng)計(jì)學(xué)家Fisher 提出，對(duì)兩個(gè)或多個(gè)樣本平均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)，具有敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS對(duì)穿心蓮種子萌發(fā)的影響

2.1.1 對(duì)種子發(fā)芽率的影響 穿心蓮種子發(fā)芽較為緩慢，隨著播種時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)芽率逐漸升高，播種6 d后，每隔2 d統(tǒng)計(jì)1次。發(fā)芽高峰在播種后10 d左右，發(fā)芽率在37.50%～64.50%。其中，0.8%EMS處理4 h的種子在播種14 d時(shí)發(fā)芽率最高，達(dá)到80.00%；而處理8 h的最低，播種14 d時(shí)僅為50.50%。對(duì)照種子在播種后6～8 d才開始發(fā)芽。低EMS濃度、短處理時(shí)間的種子發(fā)芽早，發(fā)芽率高于對(duì)照，隨著EMS處理時(shí)間延長(zhǎng)和處理濃度升高，發(fā)芽率隨之降低，呈負(fù)相關(guān)，且EMS濃度比處理時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用明顯（表1）。

2.1.2 對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響 對(duì)播種22 d成活的幼苗數(shù)進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，其成苗率和相對(duì)成苗率見表2。同一濃度下，穿心蓮的成苗率和相對(duì)成苗率隨EMS處理時(shí)間延長(zhǎng)總體呈負(fù)相關(guān)。其中，EMS濃度為0.5%、處理12 h的種子成苗率和相對(duì)成苗率最低。EMS濃度為0.8%、處理4 h種子的成苗率和相對(duì)成苗率顯著高于對(duì)照。幾種處理方式對(duì)穿心蓮種子的成苗率和相對(duì)成苗率均表現(xiàn)出不同程度的影響。EMS濃度為0.5%、處理8 h的成苗率高于其他兩個(gè)處理時(shí)間，但差異不顯著。處理時(shí)間為4 h的兩個(gè)不同濃度處理，株高和對(duì)照相比均無(wú)顯著差異。隨著EMS濃度增加和處理時(shí)間延長(zhǎng)，穿心蓮幼苗植株高度下降，和對(duì)照、處理4 h的株高存在顯著差異?？梢?，EMS對(duì)穿心蓮幼苗生長(zhǎng)的影響優(yōu)先表現(xiàn)在對(duì)植株生長(zhǎng)高度的抑制，且EMS濃度提高和處理時(shí)間延長(zhǎng)抑制幼苗的前期生長(zhǎng)。

2.2 穿心蓮?fù)蛔冾愋丸b定

對(duì)EMS誘變的穿心蓮植株群體在生物學(xué)和形態(tài)學(xué)方面的性狀進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)一些突變植株在葉型、葉色、葉序、株高、株型和花軸等形態(tài)上與正常植株（圖1A、E）表現(xiàn)出明顯差異。（1）葉部突變（圖1B、C、D）。與對(duì)照相比，經(jīng)EMS處理的穿心蓮表現(xiàn)出淡黃雜斑葉、單片葉色加深或者一葉對(duì)稱兩色等變異，可能與EMS參與促進(jìn)或抑制葉綠素的合成有關(guān)。葉型上出現(xiàn)較多葉裂、心形葉等，隨著植株生長(zhǎng)，這些變異葉片出現(xiàn)死亡，部分可恢復(fù)正常生長(zhǎng)。主莖葉序出現(xiàn)由正常株的單葉對(duì)生變異為單葉輪生，且輪生葉隨著植株的生長(zhǎng)依然保持穩(wěn)定的輪生葉序。（2）花軸變異（圖1F、G）。由對(duì)生葉變異為輪生葉的植株，其輪生葉的葉腋處均可抽出花軸，形成輪生型花軸。此外，在誘變的植株中還發(fā)現(xiàn)多株無(wú)花序軸型植株，其小花花柄直接著生于主莖或分枝上。（3）株型突變（圖1H）。在EMS誘變種子長(zhǎng)成的植株群體中，其株型也出現(xiàn)較多變異，對(duì)比正常株型，少數(shù)誘變植株出現(xiàn)矮化型、節(jié)間縮短等特異株型。（4）分枝（圖1I）。正常的穿心蓮植株從主莖的對(duì)生葉腋處抽出分支，誘變的分株從底部直接產(chǎn)生分枝，形成兩個(gè)以上主莖。（5）物候期突變：經(jīng)EMS誘導(dǎo)處理的穿心蓮植株，大多與對(duì)照保持一致的花期和生長(zhǎng)速率，少數(shù)突變體在開花期沒有開花，甚至無(wú)花軸抽出。

表1 不同EMS處理?xiàng)l件對(duì)穿心蓮發(fā)芽率的影響Table 1 Effects of different EMS treatment conditions on the germination rates of Andrographis paniculata

表2 不同EMS處理?xiàng)l件對(duì)穿心蓮幼苗生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of different EMS treatment conditions on the growth of Andrographis paniculata seedlings

圖1 穿心蓮EMS誘導(dǎo)變異類型Fig.1 Variation types of Andrographis paniculata induced by EMS

2.2.1 EMS處理誘導(dǎo)的變異率 從表3可以看出，0.5%、0.8%兩種濃度的EMS處理4 h，均不能產(chǎn)生突變體植株。但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，突變率上升。其中0.5%EMS處理 12 h誘變率最高（3.5%），適量延長(zhǎng)處理時(shí)間可提高穿心蓮種子的誘變率。

表3 不同EMS處理誘導(dǎo)穿心蓮的誘變率Table 3 Mutagenesis rates of Andrographis Paniculata induced by different EMS treatments

3 討論

穿心蓮是我國(guó)重要的中藥材之一，但存在生物學(xué)特性不一致和品種混雜退化等現(xiàn)象。穿心蓮易受生長(zhǎng)環(huán)境、栽培條件、加工處理等因素影響，產(chǎn)量和質(zhì)量不穩(wěn)定，選育抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、有效成分高的優(yōu)良品種是穿心蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。由于穿心蓮是國(guó)外引入物種，且引入時(shí)間不長(zhǎng)，分布區(qū)域有限，種質(zhì)資源匱乏，因而穿心蓮的良種選育成為亟待解決的問題。目前，突破穿心蓮育種瓶頸、創(chuàng)新穿心蓮種質(zhì)是進(jìn)行穿心蓮品種改良的基礎(chǔ)，誘變是重要?jiǎng)?chuàng)新途徑之一［22］。同時(shí)獲得具有特異發(fā)育表型的突變體材料對(duì)于開展植物基因功能研究具有重要意義［23］。EMS誘導(dǎo)是目前生產(chǎn)運(yùn)用較多的一種突變體制備方法，具有突變率高、操作易控、基因組損傷小、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)，逐漸成為獲得大量突變體樣本的優(yōu)勢(shì)技術(shù)［24-26］。不同品種穿心蓮的蠟質(zhì)層以及內(nèi)含的發(fā)芽抑制物有一定差異，可能和穿心蓮品種特性密切相關(guān)。本研究中穿心蓮種子發(fā)芽率均不高，最高僅為80%，可能與穿心蓮表面有蠟質(zhì)層、種皮致密且堅(jiān)硬、內(nèi)含有發(fā)芽抑制物且存在外致性和生理性休眠有關(guān)［27］。對(duì)穿心蓮種子進(jìn)行EMS誘導(dǎo)應(yīng)根據(jù)其品種特性，基于種子的半數(shù)致死劑量進(jìn)一步優(yōu)化最適宜穿心蓮的誘變條件［28-29］。

本研究發(fā)現(xiàn)了一些無(wú)花軸的穿心蓮?fù)蛔凅w植株和生殖生長(zhǎng)階段延遲的突變體植株，可能是EMS對(duì)其生殖器官的形成（花等）或在生殖生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生一定抑制作用，后期需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)方面的研究論證。在幼苗階段，誘變植株的葉色和葉片形狀出現(xiàn)多種變異，隨植株不斷生長(zhǎng)，葉片顏色的部分突變性狀逐漸消失，表型不再明顯，和紫花苜蓿等在EMS誘變中出現(xiàn)的現(xiàn)象相似［29］。這可能是隨著植株生長(zhǎng)而逐漸消除EMS對(duì)葉片顏色產(chǎn)生的影響，具體原因有待進(jìn)一步解析，也將是我們后期研究的重要關(guān)注點(diǎn)之一。EMS誘導(dǎo)為穿心蓮的誘變育種和功能基因組研究可提供表型豐富的遺傳材料，對(duì)穿心蓮新品種選育提供新的材料。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，穿心蓮種子萌發(fā)率與EMS處理濃度和處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān)性，其中，0.5%EMS處理12 h為穿心蓮種子的最佳誘變條件，建立了穩(wěn)定的穿心蓮EMS誘變技術(shù)。獲得突變表型豐富的突變體庫(kù)，為穿心蓮育種提供了新型種質(zhì)和突變體資源，為穿心蓮功能基因組學(xué)及新品種選育提供新材料。