張 怡，沈迎春

( 江蘇省農(nóng)藥總站，江蘇 南京 210036)

火龍果是一種風(fēng)味鮮美的特色經(jīng)濟(jì)作物，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者喜愛。自20世紀(jì)90年代初在我國(guó)臺(tái)灣試種火龍果，火龍果產(chǎn)業(yè)逐漸發(fā)展，目前我國(guó)火龍果種植面積約有50～60萬畝，主要集中在廣西、廣東、海南、云南、貴州等地[1]。近年來，農(nóng)村種植業(yè)結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整，華東地區(qū)溫室火龍果栽培逐步興起，溫室火龍果定植后壽命可達(dá)50年以上，盛果期每667m2產(chǎn)量可達(dá)400～500kg[2]，按照市場(chǎng)價(jià)格30元/kg計(jì)算，效益十分可觀，備受種植戶青睞。

火龍果在溫暖潮濕的條件下，肉質(zhì)莖易被盤圓孢屬(Colletotrichungloeosporioides(PenZ)真菌感染形成炭疽病，染病初期產(chǎn)生大量紅色病斑，隨著病情的擴(kuò)散，病斑擴(kuò)大并逐步連在一起，造成火龍果莖稈表面組織松弛，火龍果果實(shí)前期感染炭疽病不會(huì)表現(xiàn)癥狀，等生長(zhǎng)成熟后病癥逐步顯現(xiàn)，果實(shí)出現(xiàn)水漬狀的病斑[2-4]?；瘕埞N植面積的擴(kuò)大，為其病害的大流行提供了條件和場(chǎng)所，陳圓等[5]在2014～2015對(duì)海南火龍果主產(chǎn)區(qū)調(diào)研發(fā)現(xiàn)火龍果炭疽病從幼苗到果實(shí)成熟都可以發(fā)病，尤其危害果實(shí)可直接影響外觀和品質(zhì)，從而影響銷售。新修訂的《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》規(guī)定了農(nóng)藥使用者應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照農(nóng)藥的標(biāo)簽、標(biāo)注的使用范圍、使用方法和劑量、使用技術(shù)要求和注意事項(xiàng)，不得擴(kuò)大使用范圍、加大用藥劑量或者改變使用方法，而目前火龍果炭疽病并無登記藥劑可用[6-10]，探索火龍果炭疽病防治技術(shù)，建立應(yīng)急防治藥劑數(shù)據(jù)庫，確保農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全勢(shì)在必行。

本研究通過田間藥效試驗(yàn)，研究嘧菌酯、咪鮮胺對(duì)火龍果炭疽病的防治效果，探究炭疽病防治應(yīng)用技術(shù)，并對(duì)選用農(nóng)藥進(jìn)行殘留驗(yàn)證，為果農(nóng)防治炭疽病科學(xué)用藥提供數(shù)據(jù)支撐和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試靶標(biāo) 火龍果炭疽病(Gloeosporiumsp)。

1.1.2 供試藥劑 25%咪鮮胺水乳劑、250g/L嘧菌酯懸浮劑。

1.2 儀器設(shè)備 梅特勒AB135-S電子天平(精確度0.000 1 g)、試管、移液槍、JN-16C型背包式噴霧器等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 田間藥效試驗(yàn) 田間試驗(yàn)于2017年分別在鎮(zhèn)江和上海的火龍果溫室內(nèi)進(jìn)行。各試驗(yàn)地供試作物情況、靶標(biāo)發(fā)生情況、施藥日期如(表1)。施藥劑量如(表2)，葉面噴霧處理，施藥液量1 000L/hm2。鎮(zhèn)江于火龍果炭疽病發(fā)病初期，均勻噴霧1次，間隔10～16d再噴1次，共噴霧2次；上海1次用藥后，隔日用培養(yǎng)好的西瓜炭疽病菌種接種后悶棚2d，后按常規(guī)管理，第1次用藥時(shí)火龍果炭疽病未發(fā)生，間隔7d再噴霧1次，共噴霧2次。末次藥后10d調(diào)查防效。試驗(yàn)參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則第98部分《殺菌劑防治芒果炭疽病藥效試驗(yàn)》執(zhí)行。

表1 田間管理措施

表2 供試藥劑施藥劑量設(shè)計(jì)

1.3.2 殘留試驗(yàn) 殘留試驗(yàn)于2017年在江蘇、上海、廣西進(jìn)行。試驗(yàn)作物品種蜜寶(江蘇)、玫瑰紅(上海)、蓮花8號(hào)(廣西)。試驗(yàn)按照NY/T788-2004“農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則”的要求進(jìn)行，分為動(dòng)態(tài)消解試驗(yàn)和最終殘留試驗(yàn)。每處理重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每小區(qū)面積30m2。

消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)：施藥時(shí)選擇葉片生長(zhǎng)盛期的火龍果葉片，施藥應(yīng)保證用于動(dòng)態(tài)試驗(yàn)的芋株均勻著藥。施藥劑量為田間藥效試驗(yàn)最高劑量的1.5倍，噴霧后2 h、1、2、3、5、7、14、21、28 d采集火龍果莖葉樣品。每次每小區(qū)采集≥2kg生長(zhǎng)正常的火龍果樣本，另設(shè)清水空白對(duì)照。處理間設(shè)保護(hù)間隔區(qū)。

最終殘留試驗(yàn)：按照供試藥劑田間藥效試驗(yàn)推薦劑量和推薦劑量1.5倍2個(gè)劑量于火龍果葉斑病發(fā)病期施藥處理，施藥次數(shù)為2次和3次，對(duì)照區(qū)不施藥。在末次施藥后7 、14 和21d分別采樣。另設(shè)空白對(duì)照，處理間設(shè)保護(hù)帶。

1.4 樣品采集 殘留試驗(yàn)的田間樣本在采集后，立即制備成實(shí)驗(yàn)室樣品，放入冰柜中冷凍(4 h以內(nèi))。

火龍果動(dòng)態(tài)樣品的采集：采用棋盤式分布采集10株上的葉片，每株按照內(nèi)、外、中采集，每小區(qū)采葉量≥2kg，充分混勻后，用四分法縮分，取150g裝入封口容器中，容器內(nèi)外各加上標(biāo)簽，保存在-20℃冰箱中待測(cè)。

最終殘留火龍果樣品的采集：于果實(shí)成熟期，每小區(qū)按隨機(jī)取樣法取火龍果，用毛刷和干布去除泥土及其他黏附物。樣品采集量至少為6～12個(gè)個(gè)體，且≥2kg，將火龍果充分混勻后，用四分法縮分，取150g裝入封口容器中，容器內(nèi)外各加上標(biāo)簽，保存在-20℃冰箱中待測(cè)。

1.5 分析測(cè)定

1.5.1 咪鮮胺 樣品(果實(shí))經(jīng)丙酮機(jī)械振蕩提取，上清液濃縮近干，加入吡啶鹽酸鹽，在250℃沙浴鍋中衍生化后，用石油醚萃取，取上清，濃縮至干，正己烷定容，待測(cè)。

色譜柱：DB-1701 (30m×0.32mm×0.25μm)；進(jìn)樣口240℃；檢測(cè)器300℃；柱溫80℃，保持1min，以30℃/min升至160℃，保持2min，以35℃/min升至245℃，保持2min；

總流量：29.4mL/min，尾吹2.5mL/min，分流比：10.0；進(jìn)樣量：2.0μL。

咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取0.010 1g的三氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000mg/L)。用正己烷逐級(jí)稀釋成濃度為0.052、0.26、0.52、2.6、5.2mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別對(duì)應(yīng)咪鮮胺的濃度為0.1、0.5、1、5、10ppm。在上述色譜操作條件下，分別進(jìn)樣2μL。測(cè)定三氯苯酚進(jìn)樣量與峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好。標(biāo)樣線性方程為：Y=239.2891X-3395.022 5，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.999 0；其中Y為三氯苯酚峰面積，X為進(jìn)樣濃度?？梢?，三氯苯酚在0.052～5.2 mg/L范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)咪鮮胺的濃度為0.1～10ppm，濃度與色譜峰面積呈顯著的線性關(guān)系。

1.5.2 嘧菌酯 樣品經(jīng)乙腈機(jī)械振蕩提取，勻漿2min，加入Nacl(2.0g)離心，吸取上清液過0.22m的濾膜，UPLC-MS/MS測(cè)定。

準(zhǔn)確稱取樣品5.0g，放入具塞三角瓶中。加入25 mL乙腈，機(jī)械振蕩1h，靜置10min后加入2.0g的Nacl，在高速分散機(jī)中以1 000r/min勻漿2min，轉(zhuǎn)速10 000r/min下離心10min，收集上清液，待凈化。將C18固相萃取柱分別用1mL乙腈、1mL水和1mL的分析液與條件化，棄去流出液，再加入1.5mL的分析液，并用5mL的試管收集，過0.22mm濾膜，上機(jī)。

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18100×2.1mm, 3.5m，柱溫：40℃，流動(dòng)相：A: 2/98=水/甲醇(V/V)+0.05%甲酸+5mmol的乙酸銨溶液 B:甲醇+0.05%甲酸，流動(dòng)相采用梯度洗脫, 流速：0.2mL/min，進(jìn)樣量：5μL。電離方式：ESI+，毛細(xì)管電壓：3.0kv，離子源溫度：150℃，錐孔反吹氣流量：50L/Hr，脫溶劑氣溫度：400℃，脫溶劑氣流量：800L/Hr，監(jiān)測(cè)模式：MRM模式

嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取0.010 1g的嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000mg/L)。用丙酮逐級(jí)稀釋成濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述色譜操作條件下，分別進(jìn)樣5μL。測(cè)定嘧菌酯進(jìn)樣量與峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好。標(biāo)樣線性方程為：Y=868 565X+7 543.7，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.998；其中Y為嘧菌酯峰面積，X為進(jìn)樣濃度。可見，嘧菌酯在0.01～0.2mg/L范圍內(nèi)，濃度與色譜峰面積呈顯著的線性關(guān)系，可滿足定量分析的需要。

1.5 計(jì)算方法 病情指數(shù)(葉)=[∑(各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)] ×100

a—轉(zhuǎn)化系數(shù)，咪鮮胺為1.906；嘧菌酯為1

R—樣品中的農(nóng)藥含量，mg/kg

H(A)—樣品峰面積

ES—標(biāo)樣濃度，mg/kg

V—定容體積，mL

m—稱樣量

國(guó)家估算每日攝入量(NEDI)

根據(jù)規(guī)范殘留試驗(yàn)中值(STMR/STMR-P)計(jì)算或最大殘留限量(MRL)計(jì)算某種農(nóng)藥國(guó)家估算每日攝入量(NEDI或TMDI)，計(jì)算NEDI時(shí)，如果沒有合適的STMR或STMR-P，可以使用相應(yīng)的MRL，應(yīng)注明是使用中值和限量值混合評(píng)估的結(jié)果。

NEDI =∑[STMRi(STMR-Pi)× Fi)]

STMRi—農(nóng)藥在某一食品中的規(guī)范殘留試驗(yàn)中值；

STMR-Pi —用加工因子校正的規(guī)范殘留試驗(yàn)中值；

Fi—一般人群某一食品的消費(fèi)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間藥效試驗(yàn)結(jié)果 鎮(zhèn)江、上海兩地施藥后目測(cè)觀察，供試藥劑各用量對(duì)火龍果無不良影響，作物生長(zhǎng)正常。田間藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，25%咪鮮胺水乳劑和250g/L嘧菌酯懸浮劑對(duì)火龍果炭疽病具有較好的防效，兩地清水對(duì)照炭疽病病指分別為14.7和26.1，發(fā)生程度中等，咪鮮胺和嘧菌酯可以有效控制火龍果炭疽病危害。2種藥劑對(duì)火龍果炭疽病的防治效果隨著劑量增加而上升。

施用25%咪鮮胺水乳劑125～250g/hm2，末次藥后10d防效在73.4%～88.3%之間，上海試驗(yàn)區(qū)咪鮮胺效果略好于鎮(zhèn)江試驗(yàn)區(qū)，施用250g/L嘧菌酯懸浮劑100～200g/hm2，末次藥后10d防效在62.0%～85.7%之間，總體而言，25%咪鮮胺水乳劑對(duì)火龍果炭疽病防效優(yōu)于250g/L嘧菌酯懸浮劑。

表3 田間藥效試驗(yàn)結(jié)果

2.2 殘留試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明，咪鮮胺在江蘇、上海、廣西試驗(yàn)地火龍果葉片中咪鮮胺的原始沉積量為0.256～0.303mg/kg，在上海和廣西試驗(yàn)點(diǎn)的殘留試驗(yàn)中咪鮮胺在火龍果葉片中的平均殘留量與施藥間隔天數(shù)成明顯的指數(shù)關(guān)系(圖1)，江蘇試驗(yàn)點(diǎn)的殘留試驗(yàn)中咪鮮胺在火龍果葉片樣品中的咪鮮胺消解極快，無法模擬消解動(dòng)態(tài)方程。在上海、廣西試驗(yàn)點(diǎn)火龍果葉片中的消解半衰期分別為6.54、4.20d。嘧菌酯在江蘇、上海、廣西消解動(dòng)態(tài)(表4)，消解速度較快無法模擬動(dòng)態(tài)曲線。

表4 250g/L嘧菌酯懸浮劑在火龍果葉片中的消解動(dòng)態(tài)

續(xù)表

最終殘留試驗(yàn)結(jié)果表明，于火龍果成熟期采樣檢測(cè)，江蘇、上海、廣西試驗(yàn)地火龍果葉片中咪鮮胺的殘留量為<0.1～0.319mg/kg。嘧菌酯的殘留量分別為：江蘇為 <0.1～0.248mg/kg；上海為<0.1～0.229mg/kg；廣西南寧為均<0.1mg/kg。

2.3 膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 根據(jù)殘留試驗(yàn)得出，咪鮮胺規(guī)范殘留試驗(yàn)中值(STMR)為：0.1 mg/kg，最高殘留值(HR)為0.32 mg/kg；嘧菌酯規(guī)范殘留試驗(yàn)中值(STMR)為：0.1mg/kg，最高殘留值(HR)為0.248mg/kg。(表6)結(jié)果顯示，結(jié)合我國(guó)農(nóng)藥登記情況和我國(guó)居民的人均膳食結(jié)構(gòu)，普通人群咪鮮胺的國(guó)家估算每日攝入量是0.581 3mg，占日允許攝入量的92.3%，嘧菌酯的國(guó)家估算每日攝入量是0.708 5mg，占日允許攝入量的5.6%，結(jié)果表明對(duì)一般人群健康不會(huì)產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。

表5 殘留試驗(yàn)結(jié)果匯總

表6 膳食評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)

3 討論

本研究中所涉及到的2種殺菌劑都是生產(chǎn)上使用廣泛的殺菌劑，各具特色。咪鮮胺為廣譜性殺菌劑，系抑制麥角甾醇生物合成，具有保護(hù)和鏟除作用，對(duì)多種作物子囊菌和半知菌病害有顯著防效。嘧菌酯是繼1996年巴斯夫開發(fā)了第一個(gè)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑醚菌酯后，于1997年由捷利康公司(現(xiàn)先正達(dá))開發(fā)的，其比醚菌酯殺菌譜更廣，適用作物更廣泛，現(xiàn)在85個(gè)國(guó)家80余種作物上均有使用[11]。研究表明，咪鮮胺對(duì)火龍果炭疽病病菌有很好的室內(nèi)活性，其EC50為0.109 3mg/L，優(yōu)于苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇和多菌靈。陳育民等[12]研究表明，50%咪鮮胺可濕性粉劑1 500倍液2次藥后10d防效達(dá)83.4%，與本試驗(yàn)防效接近，效果優(yōu)于噁霉靈、波爾多液、氨基寡糖素和嘧菌酯，3次藥后各藥劑對(duì)火龍果炭疽病防效無明顯提高?？刂苹瘕埞烤也楹€需在前期輔以物理防治，如及時(shí)清園、摘除病葉、臭氧防治等，張耀良等[13]研究臭氧水在火龍果病蟲害防治中的應(yīng)用效果，發(fā)現(xiàn)每15d噴施臭氧水6～15mg/L，可抑制炭疽病病害增長(zhǎng)4%～13%，可作為防治火龍果炭疽病的輔助手段。

殘留試驗(yàn)期間江蘇最高溫度36℃，最低溫度11℃，平均氣溫21.4℃，雨日44 d，總降水量428.8mm；上海試驗(yàn)點(diǎn)試驗(yàn)期間最高溫度40℃，最低氣溫24℃，雨日18d；廣西試驗(yàn)點(diǎn)試驗(yàn)期間最高氣溫35℃，最低氣溫24℃，雨日27日，降雨量235mm。光解、雨水沖洗和自然分解是農(nóng)藥在植物表層組織中的降解的主要影響因素，增長(zhǎng)稀釋及農(nóng)藥遷移則促進(jìn)了內(nèi)部組織中農(nóng)藥的消解。作物品種對(duì)農(nóng)藥在火龍果中的降解影響不大。咪鮮胺、嘧菌酯在火龍果葉片中的消解速率差異較小，且消解較快，這可能與其自身理化性質(zhì)有關(guān)，在火龍果果實(shí)中殘留很少。膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果表明25%咪鮮胺水乳劑250～375g/hm2和250g/L嘧菌酯懸浮劑200～300 g/hm2施藥2次對(duì)一般人群健康風(fēng)險(xiǎn)可接受。

綜合田間防效、殘留試驗(yàn)結(jié)果，咪鮮胺和嘧菌酯適用于防治火龍果炭疽病，要注意輪換使用，防止抗藥性的產(chǎn)生。