朱永生 徐靖 蔣家煥 鄭燕梅 陳麗萍 蔡秋華 王愛榮 張建福

摘要：[目的]葉片早衰影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，早衰突變體是研究水稻衰老機制的良好載體，鑒定、分析早衰突變體的表型特征，有助于了解突變體的遺傳規(guī)律，為相關(guān)基因的克隆和功能研究奠定基礎(chǔ)。[方法]人工接種鑒定了早衰突變體wl4的稻瘟病和水稻白葉枯病抗性，同時通過對離體葉片的黑暗誘導和葉綠素含量測定，鑒定了突變體wl4的早衰表型;再分別對早衰突變體w14和野生型梗稻品種云引（簡稱'YY'）中水稻早衰相關(guān)基因和病程相關(guān)基因的表達進行分析，研究早衰突變體wl4的早衰類型及與野生型在防御系統(tǒng)上的差異。[結(jié)果]黑暗誘導處理24h后，突變體w14的葉綠素含量顯著低于野生型YY（P《0.05）。黑暗誘導處理48h以上，突變體wl4的葉綠素含量極顯著低于野生型YY（P《0.01）。突變體wl4中衰老相關(guān)基因sGR、Osh36、Osh69、PAO、NYC3和RCCRl的表達均顯著高于野生型YY。分別接種水稻白葉枯和稻瘟病后，突變體wl4均表現(xiàn)為比野生型YY更感病，且病程相關(guān)基因PRla、PR4、CthI、PR1b、PBZ1、PR3等的表達在突變體中顯著上調(diào)。[結(jié)論]突變體wl4具有典型的衰老和感稻瘟病、水稻白葉枯病的表型，與野生型相比，在突變體中與病程相關(guān)基因的表達發(fā)生了顯著改變，即突變體防御系統(tǒng)的改變導致其出現(xiàn)感病的表型。

關(guān)鍵詞：水稻;突變體;早衰;葉綠素;抗病性;基因表達

中圖分類號：S511

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）06-0626-07

0引言

[研究意義]水稻是單子葉模式植物，也是全世界最主要的糧食作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，水稻等禾谷類作物的產(chǎn)量95%來自葉片光合作用。水稻功能葉一旦在其灌漿的中后期出現(xiàn)早衰，將極大影響到種子發(fā)育過程中的糖類和其他碳水化合物的積累，從而對產(chǎn)量和品質(zhì)均造成較大的影響。通過深人研究水稻葉片早衰的分子機理，特別是水稻發(fā)生早衰后的一些重要性狀的遺傳和生理特性的變化，不僅可以從分子水平闡釋植物的生長發(fā)育和衰老的規(guī)律，探尋可行的延緩植物衰老的方法，也能通過基因工程等手段調(diào)控影響水稻重要性狀（如抗病性等）的基因，對培育抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)水稻新品種具有重要的應用價值。[前人研究進展]衰老是植物生長發(fā)育的最后一個階段，同時受到遺傳基因與外界環(huán)境的影響。在植物衰老過程中，葉片等器官中的營養(yǎng)物質(zhì)會轉(zhuǎn)移到生殖器官，這是植物在漫長的進化過程中建立的一種自我保護形式。后時，植物的自然衰老也可提高對環(huán)境的適應能力，是其生長發(fā)育的重要生命歷程。目前的研究結(jié)果表明，植物衰老是一個較為復雜的生命過程，涉及多種代謝途徑”。近年來，通過基因定位與克隆、全基因組分析等方法，已構(gòu)建了植物衰老分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的部分結(jié)構(gòu)，但其復雜的內(nèi)在機理還不夠明晰。植物葉片衰老除了受到環(huán)境因素，如受光、溫、千旱、鹽堿等各種非生物脅迫因素的影響外，也受脫落酸、乙烯、細胞分裂素等植物自身激素的調(diào)節(jié)。從植物葉片早衰數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果顯示，在水稻中已鑒定出150多個與葉片衰老相關(guān)的基因，其中經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化驗證或互補驗證的與葉片早衰相關(guān)的調(diào)控基因僅有50多個。在其中21個已克隆的水稻葉片早衰相關(guān)基因中，多數(shù)基因參與激素合成及信號傳導、葉綠素降解、過氧化反應四及逆境脅迫叫等途徑。這些研究結(jié)果顯示，早衰突變體多數(shù)是因為植物抗氧化系統(tǒng)功能下降，導致葉片衰老。因此，早衰突變體往往與某些防御反應相關(guān)基因存在一定的聯(lián)系，在植物防御機制中也具有重要的調(diào)控作[1]擬南芥hysl（hypersenescence 1）突變體在暗誘導條件下表現(xiàn)出早衰癥狀，而同時HYSl基因也是病程相關(guān)基因以，在該突變體表現(xiàn)早衰癥狀的同時，出現(xiàn)了防衛(wèi)反應相關(guān)的表型，證明某些植物的早衰癥狀與防御反應具有相同的遺傳基礎(chǔ)。[本研究切人點]目前，對早衰或者類病斑突變體的研究主要是通過遺傳學方法克隆相關(guān)基因后從生理生化的角度解釋造成植物早衰的分子機理，而從植物病程相關(guān)基因的表達差異與其防御系統(tǒng)的相關(guān)性研究鮮見報道。[擬解決的關(guān)鍵問題]本研究通過對水稻早衰突變體w14進行農(nóng)藝性狀調(diào)查、相關(guān)生理指標及病程相關(guān)基因的表達分析，以期明確早衰突變體與野生型YY之間存在的主要表型差異，為下一步遺傳群體的構(gòu)建、遺傳學分析和基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1水稻品種野生型品種云引（YY）由云南省農(nóng)業(yè)科學院提供，本研究所用的早衰突變體wl4由野生型品種YY經(jīng)0.8%EMS誘變處理后，經(jīng)多代篩選、鑒定直至自交穩(wěn)定而獲得;普感品種麗江新團黑谷（LTH）由中國農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。

1.1.2菌株用于稻瘟病抗性鑒定的24個稻瘟病菌生理小種由福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供，用于水稻白葉枯病抗性鑒定的菌株浙173、C5等均由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.2主要試劑

MES，購自國藥公司;植物總RNA提取試劑Trizol，購自全式金生物技術(shù)有限公司;cDNA鏈反轉(zhuǎn)試劑盒（ReverAidFirstStrandcDNASynthesisKit），購自Fermentas公司;熒光定量試劑盒RoxReferenceDyII（50X），購自羅氏（Roche）公司;2XPowerPfuPCRMasterMix，購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.3試驗方法

13.1田間種植和表型觀察混收經(jīng)化學誘變的M代種子，均勻播種于秧田，待秧齡28d后移栽。本田的肥力中等偏上，田間種植規(guī)格：23cmX23m，每行插7株，每10行中按相同規(guī)格移裁1行同時播種的野生型對照。按照常規(guī)大田的水肥和病蟲害管理。分別于移栽后30d、60d、90d和120d觀察并記載M，代植株的表型，選擇有典型衰老表型的單株掛牌標記，單株收種，套袋自交加代繁殖直至穩(wěn)定。

13.2水稻離體葉片抗衰老及葉綠素含量測定

別將野生型和突變體分蘗盛期的劍葉剪成1cm左右的小段，將剪斷的葉片葉脈朝下放置在0.3mol-L的MES溶液的培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋，放置于相對濕度90%、溫度25C的人工氣候箱連續(xù)96h黑暗培養(yǎng)，期間分別于24、48、72、96h進行離體葉片衰老表型的觀察，并拍照記錄結(jié)果。葉綠素含量測定按照南京建成葉綠素含量測定試劑盒說明書進行操作。

1.3.3稻瘟病抗性鑒定和調(diào)查分別將野生型和突變體種子播種于溫室內(nèi)秧盤，以普感稻瘟病品種麗江新團黑谷（LTH）為對照，播種量為20粒左右，3次重復。接種前一周澆施2%尿素1次，使秧苗葉色濃綠、葉片下垂，待秧苗長至3葉1心時，洗脫和制備稻瘟病菌孢子懸浮液（孢子濃度調(diào)整至每亳升1X10個），加入吐溫20至終濃度0.25%o，使用人工噴霧接菌，保溫保濕7d后調(diào)查并記載發(fā)病情況，調(diào)查標準按照國際水稻研究所制定的分級標準。

1.3.4水稻白葉枯病抗性鑒定和調(diào)查從超低溫冰箱取出甘油菌，在NA培養(yǎng)基上活化后備用。待接種水稻長至分蘗盛期，通過剪葉法對水稻最上層完全展開的葉片進行接種。將浙173、C5菌株分別配制成菌液濃度為oDBo0mm=0.5，等體積混勻后接種。接種后15d左右調(diào)查和記載發(fā)病情況，按照Gu等叫的調(diào)查標準進行。

1.3.5水稻葉片RNA提取及反轉(zhuǎn)錄RNA提取參照Trizol試劑盒提供的方案進行操作。提取的RNA經(jīng)NANODROP2000C測定檢測其質(zhì)量（A260：280=2.0左右，且A260：2301.8），同時經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。隨后將質(zhì)量合格的RNA進行65C熱變性5min后，立即置于冰上冷卻，再按照逆轉(zhuǎn)錄

試劑盒操作說明，清除gDNA后再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋20倍后于-20C保存?zhèn)溆谩?/p>

13.6熒光定量PCR以水稻肌動蛋白基因Actin為內(nèi)參基因，進行SYBRGreenI熒光定量PCR，反應體系參照試劑盒說明書操作。抗病相關(guān)基因OsJARl、OsAOS2、CEBiP、Chtl、OsPAL1、OsPAL2、PR3、PR4、PRS和PBZI的熒光定量PCR引物序列參照文獻[15]的方法，水稻衰老相關(guān)基因SGR、Osh36、Osh69、PAO、NYC3和RCCRI的熒光定量PCR引物序列參照文獻[6]、[16]的方法。反應在ABI7500熒光定量PCR儀上進行，反應程序為：95C，10min;95C、l5s，60C、60s，40個循環(huán)。反應結(jié)束后進行熔解曲線分析，熔解曲線按照ABI7500儀器標準程序進行。最后導出數(shù)據(jù)，并采用Excel2007進行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1突變體wl4的早衰表型鑒定

對突變體wl4和野生型YY進行全生育期表型觀案，發(fā)現(xiàn)突變體自分蘗盛期開始，基部倒二、倒三葉開始出現(xiàn)明顯的衰老表型，表現(xiàn)為葉片褪綠、萎蔫、卷曲。為了進一步驗證早衰突變體與野生型的差異，分別對分蘗初期突變體（未出現(xiàn)明顯衰老表型）和野生型的離體葉片進行人工黑暗誘導處理，結(jié)果顯示：處理前和處理24h時，突變體和野生型表型上并無顯著差異;處理48h時，突變體開始出現(xiàn)較為明顯的褪綠表型，而此時的野生型僅有輕微的褪綠;處理72h時，突變體衰老表型更為典型，葉綠素降解加速，野生型開始出現(xiàn)褪綠;至處理96h時，突變體兒乎完全失綠，衰老表型明顯，野生型尚有明顯的綠色部分（圖1-a）。

各個處理階段葉綠素含量的測定結(jié)果與表型結(jié)果相一致，未處理前野生型和突變體葉綠素含量無顯著差異;處理24h時，突變體葉片中葉綠素含量（葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的總含量，下同）比野生型降低了5.43%，差異顯著（P《0.05）;處理48h時，突變體葉片中葉綠素含量比野生型降低20.00%，差異極顯著（P《0.01）;處理72h和96h時，突變體葉片中葉綠素含量比野生型分別降低40.41%和78.97%，差異均達到極顯著水平（P《0.01）（圖1-b）。試驗結(jié)果表明，在人工黑暗誘導處理條件下，突變體葉綠素降解更快，更易衰老。

2.2突變體wl4的抗病性鑒定

眾多有關(guān)水稻類病斑和早衰突變體的研究多涉及其防御反應和抗病性增強的報道。本研究的野生型親本YY是一個具有廣譜稻瘟病抗性的地方品種，為了證實本研究的早衰突變體材料wl4的稻瘟病抗性是否發(fā)生改變，選用從福建省各稻瘟病重發(fā)區(qū)分離的24個強致病力的稻瘟病菌生理小種進行室內(nèi)噴霧接菌，抗性鑒定結(jié)果：在用于鑒定的24個菌株中，野生型YY接菌后表現(xiàn)為抗病表型的菌株有16個，抗菌株率為66.67%;突變體w14接菌后表現(xiàn)為抗病表型的菌株有8個，抗菌株率為33.33%。突變體w14的抗菌株率明顯低于野生型，其中：突變體wI4對菌株SM17019-2、NH13093、NH17028、JY15015、NH15040、NH15040、NJ08022、NH17026-4的表型由抗病變?yōu)楦胁?，表明突變體wl4的稻瘟病抗性水平明顯降低（表1）。

田間和室內(nèi)接種水稻白葉枯病的抗性鑒定結(jié)果（圖2）表明：與野生型YY相比，突變體wl4均表現(xiàn)更為感病。室內(nèi)人工接種15d時，野生型YY的平均病斑長度為1.82cm（抗病水平），而突變體w14接種15d時的平均病斑長度為7.72cm（中感水平），突變體的病斑長度極顯著長于野生型YY（P《0.01）。大田分蘗盛期田間接種15d時，野生型YY的平均病斑長度為2.65cm（抗病水平），突變體w14接種15d時的平均病斑長度為15.96cm（感病水平），突變體病斑長度極顯著長于野生型YY（P《0.01）。

2.3突變體w14與植物衰老相關(guān)基因的表達

與野生型YY相比，突變體w14在苗期至分蘗盛期在農(nóng)藝性狀和表型上并無顯著差異，前人的研究結(jié)果表明，水稻發(fā)生衰老癥狀時會有一些保守基因或者標志性基因的表達水平發(fā)生變化”，為了檢測本研究的突變體w14是否與前人的研究材料之間存在這些衰老關(guān)鍵基因的表達差異，筆者從文獻中選取了一些水稻早衰相關(guān)基因P40、NYC3、SGR、Osh36、Osh69和RCCR1作為檢測對象，以相同生育期的野生型品種YY為對照，用RT-PCR方法分別對突變體wI4和野生型YY進行表達分析，結(jié)果顯示：與野生型YY相比，突變體wl4中與葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因PA0、NYC3均顯著上調(diào)表達;促進衰老的基因Osh36和RCCRl在突變體wl4中的表達量均顯著上調(diào)，其中Osh36的上調(diào)表達的差異性達到極顯著水平（P《0.01）。此外，在突變體w14中，控制葉綠素降解的相關(guān)基因SGR的表達量顯著上調(diào)，水稻衰老的標志基因Osh69也出現(xiàn)了顯著的上調(diào)表達。本試驗中所檢測的6個衰老相關(guān)基因均表現(xiàn)為在突變體w14中的表達量顯著高于野生型YY（圖3），表明突變體的表型是一個較為典型的衰老過程。

2.4突變體w14病程相關(guān)基因的表達

筆者前期分別對突變體w14和野生型YY進行的稻瘟病和水稻白葉枯病抗性鑒定結(jié)果表明，突變體比野生型更為感病。因此，選取了水稻中11個病程相關(guān)基因進行了表達分析，結(jié)果表明：與野生型YY相比，在相同的生育期，除了防衛(wèi)相關(guān)基因CEBip和PR5在突變體中的表達比野生型低之外，其他9個基因均表現(xiàn)為上調(diào)表達，其中：PRla和PR4在突變體中的表達上調(diào)13.5～25.4倍;Cthl在突變體中的表達，苗期上調(diào)了8.5倍，但成株期卻下調(diào)93.4%;PR1b、PBZ1、PR3均在成株期即出現(xiàn)衰老表型的時候出現(xiàn)顯著上調(diào)表達（圖4a、b）。以上結(jié)果說明，突變體中這些主要的病程相關(guān)基因的表達均發(fā)生了改變，這說明突變體可能因為本身某些關(guān)鍵基因的突變造成了抵御病原菌的能力減弱，使防御體系變得更為敏感。突變體中許多病程相關(guān)基因的表達顯著上調(diào)，這與前期抗病性鑒定結(jié)果一致。

3討論與結(jié)論

衰老是植物生長發(fā)育的自然過程，也是最后階段。在植物組織衰老的過程中，體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)會逐漸由衰老器官轉(zhuǎn)移到代謝旺盛的生殖器官等部位叼。因此，植物的正常衰老不管對生殖生長還是營養(yǎng)生長而言都十分重要18。眾所周知，早衰會造成作物產(chǎn)量降低，延緩衰老能夠保證作物的產(chǎn)量。有研究表明，水稻葉片推遲1d衰老，產(chǎn)量可增加2%左右！。因此，深人研究水稻衰老的機制，并探尋可行的延緩衰老的方法對于提高水稻產(chǎn)量具有積極的意義。

近年來，科學家們利用水稻突變體，通過對其進行遺傳學和基因工程技術(shù)的研究，克隆獲得了大量的葉片衰老相關(guān)基因20。但在這些克隆的早衰相關(guān)基因中，多數(shù)是因基因突變造成的代謝過程中過氧化物累積從而造成水稻葉片細胞壞死而出現(xiàn)早衰，雖然有些突變體能夠因為體內(nèi)過氧化物的累積抵制某些病原微生物，從而表現(xiàn)出一定的抗病性，但與相同遺傳背景的野生型品種相比，這些突變體多數(shù)表現(xiàn)為形態(tài)變差，產(chǎn)量低，均不適合直接用于對栽培品種的改良，難以達到在提高作物抗病性的同時保障其產(chǎn)量和品質(zhì)的目的。本研究獲得的突變體wl4，與野生型YY相比較，其突變后表現(xiàn)為分蘗盛期出現(xiàn)早衰表型，通過進一步對水稻衰老相關(guān)基因的表達分析表明，突變體wl4中這些衰老相關(guān)基因出現(xiàn)了顯著的上調(diào)表達，表明突變體wl4經(jīng)歷了典型的衰老過程。但是與前人研究的早衰突變體材料不同的是，w14在早衰表型出現(xiàn)后表現(xiàn)出過氧化物等一些代謝產(chǎn)物的積累，但在抗病性上卻表現(xiàn)出更為感病的表型;對11個水稻病程相關(guān)基因的表達分析結(jié)果也顯示，突變體wl4中病程相關(guān)基因PRla、PR4、Cthl、PRlb、PBZ1、PR3等均表現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達，表明突變體中防御反應體系與野生型YY相比發(fā)生了較為顯著的改變。在本研究中，如果控制突變體w14早衰的基因是因功能喪失造成了其感病的表型，則可以通過過量表達該基因，使其恢復或超過野生型抗性水平;如果控制突變體w14早衰表型的基因是因基因突變激活了下游基因造成了其感病的表型，則可以通過基因編輯的方法敲除相應基因，使其獲得抗病的表型，從而實現(xiàn)在生產(chǎn)上的利用價值。如儲成才等”發(fā)現(xiàn)，植物衰老信號通路的重要成分OsNAP受ABA特異性誘導，通過直接調(diào)控葉綠素降解、營養(yǎng)再轉(zhuǎn)運及其他衰老相關(guān)基因的表達，調(diào)控葉片的衰老進程。通過降低OsNAP基因表達可顯著延緩水稻葉片衰老，延長灌漿時間，從而提高水稻結(jié)實率和千粒重，最終使水稻產(chǎn)量得到顯著提高。但是，由于植物衰老機制復雜，同時受到植物體內(nèi)信號因子的精確調(diào)控，因此其生產(chǎn)利用為期尚早。且單一基因?qū)τ诮沂舅镜乃ダ蠙C制意義有限，只有通過對上、下游基因和互作基因進行深人研究，同時構(gòu)建這些基因的遺傳網(wǎng)絡(luò)才能夠系統(tǒng)地解釋植物衰老的內(nèi)在機制，從而進一步利用其遺傳規(guī)律對育種和生產(chǎn)提供幫助和指導。

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（責任編輯：楊小萍）

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