吳瓊 王明月 葛會(huì)林 馬晨 呂岱竹

摘要：[目的]采用溶劑萃取法提取紫皮豇豆中的總多酚，多酚提取物經(jīng)大孔樹脂分離純化，再利用高效液相色譜（HPLC）分析其多酚類化合物的組成及含量，為紫皮豇豆中多酚類物質(zhì)的提取、分析提供理論依據(jù)。[方法]以總多酚提取量為考察指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)，分析提取溶劑、料液比、溫度和pH對(duì)紫皮豇豆總多酚提取量的影響，再通過SephadexLH-20大孔樹脂對(duì)粗提物進(jìn)行分離純化，并建立紫皮豇豆中6種多酚類組分的HPLC分析方法，采用外標(biāo)法定量。[結(jié)果]紫皮豇豆中總多酚的最佳提取工藝為：經(jīng)料液比1：5（m：V）的80%丙酮水溶液，在4C、pH6條件下，提取3次，每次提取5h時(shí)，所得的總酚含量最高為614mg（GAE）.100g。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，沒食子酸、沒食子兒茶素、綠原酸、蘆丁、p-香豆酸和阿魏酸等6種多酚單體在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9959～0.999，方法檢出限和定量限分別為0.1～1mg：100g和0.2～2.5mg：100g;加標(biāo)試驗(yàn)平均回收率74.3～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.4～8.6%。經(jīng)HPLC分析，紫皮豇豆中6種多酚單體均有檢出，含量在0.46～6.5mg：100g"，其中含量最高的是蘆丁。[結(jié)論]采用80%丙酮水溶液提取紫皮豇豆總多酚，并利用HPLC法測(cè)定紫皮豇豆中幾種單體酚的方法提取率高、準(zhǔn)確性好，適用于紫皮豇豆中多酚類化合物的提取及定性定量分析。

關(guān)鍵詞：紫皮豇豆;多酚;提取純化;成分分析

中圖分類號(hào)：TS201.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（2020）060673-09

0引言

[研究意義]海南產(chǎn)紫皮豇豆（PurpuraRubrumVignaUnguiculataSubsp.Cylindrica）為短莢豇豆，豆莢長(zhǎng)約25～30cm，耐熱適合夏季種植。紫皮豇豆中除含有易于消化吸收的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、豐富的脂肪膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外叫，還含有豐富的多酚類化合物引，有健脾補(bǔ)腎、消脂降糖及促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)等功效，是一種優(yōu)質(zhì)的稀有蔬菜，具有較高的保健價(jià)值。盡管多酚廣泛存在于蔬菜、水果及茶葉等植物源性食物中，但是它在不同食物中的含量和結(jié)構(gòu)有很大差異+-5，且相較于一般蔬菜，普遍認(rèn)為深色蔬菜中的多酚類物質(zhì)含量更高”一切。多酚（Plantpolyphenol）也稱植物單寧，是一類從植物源性食物中發(fā)現(xiàn)的，具有保健作用的物質(zhì)，由多種環(huán)狀酚類化合物聚合而成，也被稱為“第七類營(yíng)養(yǎng)素”按分子量和結(jié)構(gòu)的不同主要分為兩大類，即多酚單體和由單體聚合而成的低聚或多聚體的單寧類物質(zhì)。其中，多酚單體因具有抗氧化、清除亞硝酸鹽、調(diào)節(jié)肥胖、預(yù)防癌癥、心臟病等功效，近年來(lái)成為眾多學(xué)者廣為研究的對(duì)象0-。[前人研究進(jìn)展]隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，植物源性食物中多酚物質(zhì)的提取方法得到不斷優(yōu)化，其中，常用的是溶劑萃取法。陸廣念等2研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)綠豇豆經(jīng)75%乙醇超聲提取得到的總多酚含量為74.071mg100g，總多酚的含量在10種蔬菜中僅次于藕、大蒜和菠菜;林寶妹等！3優(yōu)化了嘉寶果葉片總多酚的提取工藝，采用優(yōu)化后的工藝提取嘉寶果葉片總多酚含量可達(dá)33.84%，比已報(bào)道的方法提取的嘉寶果葉片總多酚含量高23.63%;張東峰等叫采用80%甲醇溶液提取柑橘果皮及果肉中的多酚，并對(duì)比了其中不同柑橘品種的總多酚含量，其中柑橘果皮的多酚含量（GAE）為2477～4748mg100g，其中以塔羅科血橙皮中多酚含量最多。本課題組前期通過浸提的方法獲取多酚、花色苷和磷脂，發(fā)現(xiàn)紫皮豇豆中的多酚類物質(zhì)體外降糖效果較好，總多酚含量與a-葡萄糖苷酶抑制活性存在顯著正相關(guān)性，提高提取物中總多酚含量可增強(qiáng)對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制活性以。[本研究切入點(diǎn)]已有文獻(xiàn)報(bào)道了長(zhǎng)綠豇豆多酚的總含量，但對(duì)于紫皮豇豆中多酚類物質(zhì)的提取工藝及組成分析尚未見報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]為高效獲取紫皮豇豆多酚，本文采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過溶劑提取的方法研究紫皮豇豆總多酚的提取工藝，建立測(cè)定紫皮豇豆中6種多酚單體的HPLC檢測(cè)方法，旨在為紫皮豇豆多酚類物質(zhì)的提取、分析及新品種的選育與開發(fā)利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1儀器、材料與試劑

1.1.1儀器設(shè)備sYNERGY2多功能微孔板檢測(cè)儀;晶安石英96孔酶標(biāo)板;高效液相色譜儀配有紫外檢測(cè)器（Waterse2695）;色譜柱（WatersPAHC185um，4.6X250mmColumn）;玻璃層析柱（5X25cm）;微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）;高速冷凍離心機(jī)（HITACHICR22N）;冷凍千燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司）;AL204電子天平（感量0.0001g，瑞士Metler-Toledo公司）;SynergyUV超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）;移液槍以及其他實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。

1.1.2試驗(yàn)材料紫皮豇豆采自?？?，市售新鮮，品種為“八月豆”。

1.1.3試驗(yàn)試劑標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸（Gallicacid）、沒食子兒茶素（GC）、綠原酸（Chlorogenicacid）、蘆?。≧utin）、p-香豆酸（p-Coumalicacid）和阿魏酸（Ferulicacid）標(biāo)準(zhǔn)品（純度》98.0%，購(gòu)自源葉生物科技有限公司）;丙酮、甲醇和乙醇均為色譜純（美國(guó)ThermoFisherScientific公司）;SephadexLH-20（羥丙基葡聚糖凝膠）填料（美國(guó)GE公司）;試驗(yàn)用水為MilliporeDirect-Q5超純水儀制備，甲酸等其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2高效液相色譜條件

WatersPAHC18色譜柱（5um，4.6mmX250mm），柱溫：30C;流速1.00mL;min';進(jìn)樣量：10p山;流動(dòng)相A為0.2%（VV）甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫程序：0～1min，10%A;1～4min，10%～25%A;4～1lmin75%～90%A;l1～15min，10%A;檢測(cè)波長(zhǎng)：0～5.8min，278m;5.8～15min，327m。

2.1.2溫度對(duì)總多酚提取率的影響以80%的丙酮溶液為提取溶液，考察溫度對(duì)總多酚提取率的影響。由圖2可以看出，提取溫度為4C時(shí)紫皮豇豆總多酚的提取率最高為74.5%，隨著溫度提高提取率變化不大。考慮試驗(yàn)的實(shí)際操作，選取4C作為最佳的提取溫度。

2.1.3料液比對(duì)總多酚提取率的影響以80%的丙酮溶液為提取溶液，考察料液比對(duì)總多酚提取率的影響。由圖3可以看出，紫皮豇豆總多酚的提取率隨著料液比的增加而升高。當(dāng)料液比為1g：5mL時(shí)，總多酚的提取率最大為78.1%，繼續(xù)增加提取溶劑量提取率變化不大，當(dāng)料液比達(dá)到1g：10mL時(shí)出現(xiàn)總多酚提取率下降的趨勢(shì)?？紤]環(huán)境友好及試驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)性，選取1g：5mL作為最佳的料液比。2.1.4pH對(duì)總多酚提取率的影響多酚類物質(zhì)大部分呈弱酸性，因此，試驗(yàn)選擇偏酸性條件考察pH對(duì)總多酚提取率的影響。從圖4可以看出，pH對(duì)紫皮豇豆總多酚的提取具有顯著的影響，pH=6時(shí)提取效果最好為78.6%。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1正交試驗(yàn)結(jié)果由表3可知，通過極差分析得出影響紫皮豇豆總多酚提取量4個(gè)因素的主次關(guān)系為：A（提取溶劑）》D（pH）》C（溫度）》B（料液比），提取溶劑對(duì)反應(yīng)的影響最大，對(duì)于收率指標(biāo)的最佳工藝組合為ABjC，D，但因素C中水平2和3相差不大，本著節(jié)省成本、減少溶劑用量、降低環(huán)境污染的原則，本試驗(yàn)選擇水平2作為提取條件。即最佳工藝組合為AjB，C，D，提取溶劑為80%丙酮，提取溫度為4C，料液比m欄品（g）：V溶訓(xùn)（mL）=1：5，pH為6為最優(yōu)提取條件。采用優(yōu)化后的方法得到紫皮豇豆中的總多酚提取液，在45C下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去兩酮，剩余溶液經(jīng)過冷凍千燥得到多酚提取物2.32g。

2.2.2正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證按照最佳的反應(yīng)條件做3次重復(fù)試驗(yàn)，紫皮豇豆提取物中總多酚含量平均值為614mg（GAE）100g，高于表2中任何組合，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%，試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性很好，說(shuō)明該試驗(yàn)條件選取得當(dāng)。

2.3檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

2.3.1流動(dòng)相的選擇采用0.2%（V/V）甲酸水溶液一乙腈為流動(dòng)相，沒食子兒茶素等兒茶素類化合物、蘆丁等黃酮類化合物和沒食子酸、阿魏酸、綠原酸和p-香豆酸等酚酸類化合物各組分有良好的峰形且相較于不加甲酸的流動(dòng)相有更好的響應(yīng)值，對(duì)比圖見圖5。紫皮豇豆中的黃酮類和酚酸類多酚物質(zhì)的共同特征是具有羥基或同時(shí)含有羥基與羧基等官能團(tuán)，表現(xiàn)出一定的弱酸性，甲酸的加入有利于抑制多酚類化合物與色譜柱的靜電作用，減少拖尾，改善峰形。因此，試驗(yàn)中選用0.2%（V/V）甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫。

2.3.2波長(zhǎng)的選擇試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沒食子酸和沒食子兒茶素的紫外吸收波長(zhǎng)在270nm～280nm，綠原酸、蘆丁、p-香豆酸和阿魏酸的紫外吸收波長(zhǎng)在300nm～350nm，各個(gè)成分吸收效果最好。本試驗(yàn)選用分段掃描的方式，所選取的液相色譜柱可保證沒食子酸和沒食子兒茶素在5.110min前有保留，在5.8min將掃描波長(zhǎng)由278nm切換到327nm，所有多酚類化合物均呈現(xiàn)良好的響應(yīng)值。

2.3.3方法評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（yg*mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9959～0.9999（表4）。確定方法的檢出限為0.1～1mg：100g和定量限為0.2～2.5mg·100g，能滿足定量分析的要求。樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)平均回收率74.3%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.4%～8.6%，結(jié)果見表5。純化后紫皮豇豆多酚組成成分的HPLC色譜圖見圖6-b，圖6-a為同等色譜條件下6種多酚標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的HPLC色譜圖。

2.4紫皮豇豆樣品的測(cè)定

收集10份海南產(chǎn)八月豆紫皮豇豆樣品，按照2.2.1正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的提取方法及1.4.5純化方法得樣品待測(cè)溶液，按1.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析，具體結(jié)果見表6。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，在所采集的樣品中6種多酚組分均有檢出，平均含量為0.462～6.479mg：100g。結(jié)果表明，在紫皮豇豆中6種多酚單組分平均含量最高的是蘆丁，其次是p-香豆酸，含量最低的是沒食子酸。

3討論與結(jié)論

本研究利用有機(jī)溶劑提取法，以八月豆為原材料，對(duì)紫皮豇豆多酚提取工藝進(jìn)行研究。以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，提取溶劑、溫度、pH和液料比等因素對(duì)多酚提取效果均有一定的影響，其中，提取溶劑對(duì)提取效果的影響最大。水是植物多酚的良好溶劑，但是提取中多酚往往與蛋白質(zhì)、多糖相結(jié)合，需要斷裂氫鍵，經(jīng)試驗(yàn)論證丙酮和水的復(fù)合體最適合紫皮豇豆中多酚的提取。從正交試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，最佳，工藝條件：提取溶劑為80%丙酮，提取溫度為4C，料液比m樣品（e）：V提取溶劑（mL）=l：5，pH為6為最優(yōu)，用最優(yōu)工藝條件測(cè)得紫皮豇豆中總多酚的含量為614mgGAE·100g。

雖然多酚提取方法的研究較多，但針對(duì)紫皮豇豆尤其是海南產(chǎn)八月豆中多酚的研究甚少，陸廣念等叫報(bào)道的采用75%乙醇提取的長(zhǎng)綠豇豆總多酚含量為74.071mg：100g，低于本試驗(yàn)從紫皮豇豆中提取得到的總多酚含量。分析原因可能是紫皮豇豆中除含有酯化、糖苷化的多酚類大分子化合物以及單寧類物質(zhì)外叫，還含有大量的花青素等類黃酮色素類物質(zhì)。此類物質(zhì)在利用大孔樹脂吸附法對(duì)多酚粗提物進(jìn)行分離純化時(shí)，保留在層析柱中未被洗脫出來(lái)，而低分子量多酚類化合物則是利用乙醇洗脫得到。除去溶劑后再利用HPLC對(duì)純化后的多酚類物質(zhì)進(jìn)行組分分析，通過對(duì)色譜條件的優(yōu)化，建立了PLC法同時(shí)測(cè)定紫皮豇豆中沒食子兒茶素、綠原酸、蘆丁、沒食子酸、p-香豆酸和阿魏酸等兒茶素類、黃酮類及酚酸類多酚化合物的檢測(cè)方法，紫皮豇豆中6種多酚單體含量最高的是蘆丁為6.479±0.130mg：100g。以上研究結(jié)果表明：多酚雖然廣泛存在于植物體內(nèi)，但由于植物成分的復(fù)雜性，在不同種類和品種中的含量差異較大，必須對(duì)其提取工藝進(jìn)行摸索和優(yōu)化，并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，才能夠得到比較科學(xué)、合理的數(shù)據(jù)。

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（責(zé)任編輯：吳宇琳）

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