王彥兵 匡鈺 李國明 劉小瓊 蘇琳琳 王曉媛 李守嶺

摘要：[目的]優(yōu)化咖啡果皮多酚提取工藝條件，為其功能性開發(fā)和綜合利用提供技術(shù)參考。[方法]采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)方法對超聲輔助提取咖啡果皮多酚工藝進(jìn)行優(yōu)化，比較分析咖啡果皮多酚體外抗氧化活性。[結(jié)果]在超聲功率200W條件下，咖啡果皮多酚的最佳提取工藝條件為料液比m（g）：v（mL）=1：54，乙醇體積分?jǐn)?shù)56%，提取時(shí)間42min，提取溫度69C，多酚提取率為34.68mg：g。表明咖啡果皮多酚具有較好的還原性，對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基有一定的清除能力，ICso值分別為2.10、314.97、322.02HgmL，其清除能力分別是L抗壞血酸的0.99倍、0.52倍、0.12倍。[結(jié)論]響應(yīng)面優(yōu)化工藝提取的咖啡果皮多酚具有一定抗氧化活性，提取工藝可行性高。該研究可為咖啡加工廢棄物的再利用提供參考。

關(guān)鍵詞：咖啡果皮;多酚;超聲輔助;提取工藝;抗氧化

中圖分類號：TQ460.9;S38

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）06-0682-09

0引言

[研究意義]咖啡（RubiaceaeCoffeaL.）因其復(fù)雜宜人的風(fēng)味和來自咖啡因的刺激作用，成為世界上最受歡迎的飲料之一，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，是僅次于石油的第二大貿(mào)易商品，生產(chǎn)上栽培的主要有小粒種咖啡（CoffeaarabicaL.）和中粒種咖啡（CoffeacanephoraPierreexFroehn.），分別占世界咖啡產(chǎn)量的60%和40%。小?？Х纫蚱洫?dú)特的風(fēng)味特點(diǎn)倍受消費(fèi)者青睞，我國的小?？Х确N植區(qū)主要分布在云南省，2018年其種植面積及生豆產(chǎn)量均為全國的98%以上！5-4?？Х葷穹庸み^程易于控制其品質(zhì)穩(wěn)定性，云南省小?？Х?0%以上都采用濕法加工生產(chǎn)水洗咖啡。果皮作為初級副產(chǎn)物，大部分被遺棄。而咖啡果皮約占咖啡干重的29.0%，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。植物多酚是一種天然還原性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以清除細(xì)胞中多余的自由基，防止細(xì)胞受損，在食品、日化和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用?？Х裙ぶ泻谢ㄇ嗨亍⒕G原酸、咖啡酸和阿魏酸等多酚類物質(zhì)，研究其提取工藝有利于環(huán)境保護(hù)及促進(jìn)咖啡中天然活性成分的持續(xù)挖掘。[前人研究進(jìn)展]近年來，國內(nèi)外對咖啡果皮多酚及其抗氧化活性已有一些研究，Arellao-Gonzilez等叫、陳小偉等碼研究了咖啡果皮發(fā)酵前后多酚含量變化趨勢，發(fā)現(xiàn)咖啡果皮經(jīng)發(fā)酵后其多酚含量顯著上升，對自由基的清除能力顯著增強(qiáng);張?jiān)弃Q等叫發(fā)現(xiàn)咖啡果皮中花青素主要為矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷，清除DPH和ABTS自由基的ICso值分別為1.082、1.085mg·mL;付曉萍等5發(fā)現(xiàn)咖啡果皮粗提液對氧化損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有一定的保護(hù)和恢復(fù)作用;Duangjai等探討了不同前處理過程咖啡果皮多酚的含量、抑菌活性及抗氧化活性的差異。[本研究切入點(diǎn)]超聲波輔助提取具有操作方便、省時(shí)、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于植物多酚的提取研究，然而關(guān)于咖啡果皮多酚的提取工藝卻鮮有報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]本研究運(yùn)用響應(yīng)面方法優(yōu)化小粒咖啡果皮多酚提取工藝，并研究其體外抗氧化活性，為其天然活性成分的提取及綜合利用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

小粒咖啡鮮果（卡蒂姆CHC7963），采摘于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部瑞麗咖啡種質(zhì)資源圃;無水乙醇、焦性沒食子酸、L抗壞血酸、硫酸亞鐵、30%過氧化氫、鐵氰化鉀、三氯化鐵（均為AR）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;DPPH（BR）：山東西亞化學(xué)股份有限公司;磷酸二氫鈉、無水碳酸鈉、磷酸氫二內(nèi)、三羥甲基氨基甲烷（均為AR）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;三氯乙酸（AR）：成都市科隆化學(xué)品有限公司;水楊酸（AR）：上海試劑一廠;沒食子酸（AR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鹽酸（GR）：西隴化工股份有限公司;福林酚：北京索萊寶科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程樣品洗凈一半濕法脫皮，收集果皮——水洗法去除果膠-50C真空千燥果皮——粉碎，過60目篩——稱取1.0g樣品粉末——設(shè)定條件下超聲浸提（功率200W，頻率40kHz）——離心（4000rmin1）后收集上清液——備用。

1.2.2多酚含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：采用福林一酚比色法。配制質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mgmL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取各標(biāo)準(zhǔn)液1.0mL置于10mL比色管中，加人0.2mL福林酚，3～8min加入2mL7.5%Na，CO;，純水定容，避光靜置60min。以純水代替試劑作為對照，760m處測定吸光值。繪制沒食子酸質(zhì)量濃度（X）與吸光度（Y）之間的線性關(guān)系，得到回歸方程：Y=9.3086X+0.0073，R*=0.9990。

總酚含量測定及提取率計(jì)算：取1.0mL提取稀釋液于比色管中，按上述方法求得提取液多酚濃度，多酚提取率見公式（1）。

式中：Y，咖啡果皮多酚提取率（mg：g'）;C，稀釋液中總酚質(zhì)量濃度（mg：mL"）;n，稀釋倍數(shù);V，提取液總體積（mL）;m，咖啡果皮質(zhì)量（g）。

1.2.3單因素試驗(yàn)依次考察不同因素對咖啡果皮多酚提取率的影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲時(shí)間50min、超聲溫度50C，料液比設(shè)置為1：10、l：20、1：30、1：40、1：50、1：60（g：mL）;固定料液比l：50（g：mL）、超聲時(shí)間50min、超聲溫度50C，乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為30%、40%、50%、60%、70%、80%;固定料液比1：50（g：mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度50C條件下，超聲時(shí)間設(shè)置為30、40、50、60、70、80min;固定料液比1：50（g：mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間40min，超聲溫度設(shè)置為30、40、50、60、70、80C。1.2.4超聲提取工藝優(yōu)化在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-behnken中心組合試驗(yàn)原理，優(yōu)化咖啡果皮多酚提取工藝（表1）。

2.3.2羥自由基清除能力測定由圖7可知，一定范圍內(nèi)，咖啡果皮多酚和L-抗壞血酸對羥自由基的清除能力隨濃度的增加而增強(qiáng)，二者質(zhì)量濃度為500ug：mL^時(shí)，清除率分別為69.33%、9949%?？Х裙ざ喾訉αu自由基清除率的抑制方程為y=-1.1679+2.4689x，r=0.9947，ICso=314.97pugmL;L-抗壞血酸對羥自由基清除率的抑制方程為y=-6.1049+5.0094x，r=0.9786，ICso=164.75yg·mLICso值表明咖啡果皮多酚清除羥自由基清除能力是L-抗壞血酸的0.52倍。

2.3.3超氧陰離子自由基清除能力測定超氧陰離子自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)（圖8）。

咖啡果皮多酚對超氧陰離子自由基清除率的抑制方程為y=-1.4214+2.5605x，r=0.9690，ICso=322.02yg·mL';L-抗壞血酸對超氧陰離子自由基清除率的抑制方程為y=2.1825+1.7885x，r=0.9616，ICso=37.61g：mL。由ICso值可知咖啡果皮多酚對超氧陰離子自由基清除能力是L-抗壞血酸的0.12倍。

2.3.4總還原力測定采用普魯士藍(lán)法評價(jià)咖啡果皮多酚總還原力，還原力的大小以吸光度衡量，吸光度越大，還原力越強(qiáng)。如圖9所示，在一定范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度呈正比，即還原力隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng);同等濃度下，咖啡果皮多酚還原力高于L-抗壞血酸，質(zhì)量濃度為60.0yg·mL'時(shí)，吸光度分別為0.676、0.633，表明咖啡果皮多酚具有優(yōu)良的還原力。

3討論與結(jié)論

超聲波輔助乙醇溶液法提取植物多酚，提取劑安全無毒且可回收，提取法可進(jìn)行等比例放大，是一種常用的操作方便、省時(shí)、環(huán)境友好且經(jīng)濟(jì)效益高的多酚提取方法。本試驗(yàn)采用該方法提取咖啡果皮多酚，提取時(shí)間為42min，提取率34.68mg*g。Chalalai等采用乙醇浸泡法提取咖啡果皮多酚，提取時(shí)間為72h，而提取率僅為13.21mg*g'。相比之下，超聲波提取方法省時(shí)高效，適用于對咖啡果皮多酚的提取。

天然抗氧化劑能夠清除自由基，預(yù)防和抑制腫瘤和心血管疾病的發(fā)生，介于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)周期長，抗氧化活性篩選主要集中在體外模擬測定。多酚類化合物能釋放酚羥基上氫離子，終止氧化反應(yīng)，表現(xiàn)出抗氧化生物活性，對加工副產(chǎn)物多酚活性進(jìn)行評價(jià)，可為天然多酚的開發(fā)提供一定參考。趙光遠(yuǎn)等25對石榴渣多酚提取物經(jīng)行DPPH自由基清除率測定，表明提取液抗氧化活性與濃度呈正相關(guān);徐彩紅等29采用超聲輔助酶解法優(yōu)化玉米皮多酚提取工藝，并對玉米皮DPPH自由基和ABTS+自由基清除率進(jìn)行測定，表明玉米皮多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力;令博等7對葡萄皮渣多酚提取液采用DPPH清除法和鐵氰化鉀法，進(jìn)行體外抗氧化活性研究，結(jié)果表明葡萄皮渣中的多酚能有效清除DPPH自由基并且具有較強(qiáng)的還原能力。本試驗(yàn)研究了咖啡果皮多酚對DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基的清除能力，在此基礎(chǔ)。上計(jì)算了咖啡果皮多酚清除3種自由基的ICso值。ICso值與抗氧化活性成反比，其值越小，抗氧化活性越強(qiáng)。由計(jì)算結(jié)果可知，咖啡果皮多酚對DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力，清除效果由強(qiáng)至弱?？Х裙ざ喾愚D(zhuǎn)化Fe*至Fe*的能力優(yōu)于同等濃度下L抗壞血酸。體外抗氧化活性結(jié)果的差異可能是由咖啡果皮多酚純度及羥基位置結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致，因此，在后續(xù)研究中將對咖啡果皮多酚進(jìn)行純化，進(jìn)一步研究其生物活性。

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（責(zé)任編輯：張梅）

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