摘要：[目的]轉(zhuǎn)crylAa基因棉花南農(nóng)6號為我國未經(jīng)批準商業(yè)化種植的棉花品種。為監(jiān)測其非法種植，解決陽性標準品不容易獲得的問題，構(gòu)建適合轉(zhuǎn)cylAa基因棉花南農(nóng)6號品系特異性檢測的質(zhì)粒分子pMD-NN6，以該質(zhì)粒分子作為標準物質(zhì)，建立相應(yīng)的實時熒光定量PCR方法。[方法]根據(jù)南農(nóng)6號轉(zhuǎn)化體特異序列和棉花內(nèi)標準基因acpl設(shè)計引物，采用重疊PCR方法構(gòu)建質(zhì)粒分子;以質(zhì)粒分子作為標準物質(zhì)，南農(nóng)6號轉(zhuǎn)化體特異序列為靶標，建立了南農(nóng)6號棉花特異性定量檢測方法。[結(jié)果]構(gòu)建的質(zhì)粒全長為3148bp，含有南農(nóng)6號品系特異性序列和棉花acpl基因序列兩個靶標片段的質(zhì)粒分子，定量標準曲線斜率和擴增效率均符合要求，定量檢測限為30拷貝。兩個已知南農(nóng)6號含量的混合樣品（2.0%和0.5%）定量檢測的準確度標準偏差均在土25%范圍內(nèi)，精確度相對標準差均S25%。[結(jié)論]建立的PCR定量檢測方法可以用于含有南農(nóng)6號轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)品的品系特異性定量檢測，所構(gòu)建的標準質(zhì)粒pMD-NN6可以代替其基因組DNA作為標準物質(zhì)使用。

關(guān)鍵詞：抗蟲棉;質(zhì)粒分子;acpl基因;crylAa基因;品系特異性實時PCR

中圖分類號：S562

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）06-0569-07

0引言

[研究意義]棉花是我國大面積商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物。2017年最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，我國轉(zhuǎn)基因棉花種植面積為290萬hm，達到了棉花種植總面積的95%以上。目前我國批準種植的棉花品種僅2018年就達到了330多個品種，包括美國孟山都公司的MON531和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所的國抗系列GK12和sGK321等。另外，MON15985、LLcotton25、抗蟲棉花COT102、GHB614、MON1445、MON88913等品系被允許進口用作加工原料。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉外源基因類型以crylAc基因和crylAb/Ac融合基因為主，還有一部分CpTItcrylA基因，品種多、來源廣（http：//www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/index1.htm）。轉(zhuǎn)crylAa基因棉花南農(nóng)6號（F代，下同）為一種未經(jīng)批準商業(yè)化種植的棉花品種，國外也尚未見商業(yè)化種植的報道，但是在我國的棉花種植中被檢測到”。因此，開發(fā)快速的特異性檢測方去，用來監(jiān)測轉(zhuǎn)crylAa基因棉花南農(nóng)6號的非法種植是非常必要的。[前人研究進展]目前，PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因作物檢測中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。實時熒光定量PCR技術(shù)以其特異性強、重復(fù)性好、靈敏度高和高通量等優(yōu)點成為PCR技術(shù)的首選。其檢測的靶標包括轉(zhuǎn)基因元件、構(gòu)建特異性序列、基因特異性序列和轉(zhuǎn)化體（品系）特異性序列。其中，品系特異性檢測的特異性最強。轉(zhuǎn)基因棉花MON531、MON757、GK12、MON15985和MON88913等的品系特異性實時熒光定量PCR方法均有報道"7。我國對轉(zhuǎn)基因植物及其成分雖然實施沒有閾值的標識制度，但制定實施了一系列標準，包括主要轉(zhuǎn)基因成分的檢測標準如35S啟動子、tnos終止子、Bt基因、gus基因、CpTI基因等。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花Lcotton25、MON88913、MON1445等的定性PCR檢測標準陸續(xù)建立起來一叫，并建立了專門針對crnylAa基因表達盒特異性檢測方法”。王葉等對轉(zhuǎn)crylAa基因棉花南農(nóng)6號F1的整合結(jié)構(gòu)進行了解析，獲得213bp的5'旁側(cè)序列，并以基因組DNA為標準品，建立了實時熒光定量PCR方法叫。[本研究切人點]植物基因組DNA是轉(zhuǎn)基因?qū)崟r熒光定量檢測常用的標準品，但是不容易大量獲得、純度也較低，長期放置穩(wěn)定性差。近幾年，質(zhì)粒分子因為穩(wěn)定性好、成本低、純度高、容易獲得的優(yōu)勢，在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域逐漸發(fā)展成為廣受歡迎的一種基因組DNA替代品嗎。作為定性檢測的陽性對照和定量標準物質(zhì)，質(zhì)粒DNA更適合對多個靶標基因同時檢測明。基于質(zhì)粒分子作為標準物質(zhì)的轉(zhuǎn)crylAa基因棉花南農(nóng)6號的定量方法尚未見報道。[擬解決的關(guān)鍵問題]本研究構(gòu)建含有crylAa基因棉花南農(nóng)6號品系特異性序列和棉花acpl內(nèi)標準基因兩個靶標的質(zhì)粒分子，以該質(zhì)粒分子作為標準品，建立適合南農(nóng)6號品系特異性定量檢測的實時熒光定量PCR方法，有效解決了陽性基因組DNA標準品不容易獲得的問題，實現(xiàn)對南農(nóng)6號品系非法種植的有效監(jiān)測。

1材料與方法

1.1材料準備和DNA提取

抗蟲棉南農(nóng)6號（江蘇神農(nóng)大豐種業(yè)科技有限公司，國審2005016）種子由當?shù)胤N子市場購買。其他棉花樣品均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心提供，采用植物基因組提取試劑盒提取單粒棉花基因組DNA。

1.2引物和探針

引物和探針的詳細信息如表1所示。質(zhì)粒構(gòu)建引物、特異性引物和定量引物根據(jù)南農(nóng)6號轉(zhuǎn)化體特異序列（登錄號HQ233648）設(shè)計。棉花acpl基因作為內(nèi)標準基因，根據(jù)國家標準設(shè)計則。本研究所有引物和探針均采用Primer2.0軟件（AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA）設(shè)計。引物由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。探針由上海英俊生物技術(shù)公司合成，5'端和3'端分別標記FAM熒光基團和BHQl猝滅基團。

1.3重組質(zhì)粒分子的制備

采用重疊PCR方法使用兩對引物acpl-F/R和acp-mn6/nn6-QR，以南農(nóng)6號基因組DNA為模板，分別擴增并連接南農(nóng)6號品系特異性片段和棉花acpl內(nèi)標準基因片段。獲得的重組片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM110感受態(tài)細胞，進行克隆、測序。

1.4質(zhì)粒DNA提取和稀釋

經(jīng)測序驗證序列正確的重組質(zhì)粒菌液于37C搖培至對數(shù)生長期，提取質(zhì)粒DNA，分別用分光光度計和0.8%凝膠電泳檢測其完整性并測定濃度。

用超純水將質(zhì)粒DNA稀釋為3X10～3X10'拷貝的7個系列濃度梯度（相當于每每應(yīng)分別加入3X10'～3X10'拷貝質(zhì)粒DNA），用于建立標準曲線和定量方法的評價。標準曲線建立，每個濃度梯度重復(fù)測3次，每次3個平行;定量方法評價，每個濃度重復(fù)測3次，每次4個平行。

1.5兩個南農(nóng)6號混合樣品的制備

使用南農(nóng)6號單粒種子和非轉(zhuǎn)基因棉花單粒種子制備2.0%和0.5%兩個不同質(zhì)量百分比含量的混合樣品。提取DNA作為模板用于定量方法對實際混合樣品的檢測，驗證準確度和精確度。每個樣品DNA重復(fù)測3次，每次3個平行。

1.6PCR條件

常規(guī)PCR、重疊PCR、定量PCR反應(yīng)體系和程序均參照文獻[14]的方法。

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)粒分子構(gòu)建

使用重疊PCR方法成功構(gòu)建了含有209bp的南農(nóng)6號品系特異性序列和210bp的acpl內(nèi)標準基因序列兩個靶標片段的質(zhì)粒分子pMD-NN6，為閉合環(huán)

狀雙鏈DNA，全長3148bp，其結(jié)構(gòu)圖和序列詳細信息見圖1。

2.2引物特異性

目前我國市場商業(yè)化種植的抗蟲棉外源基因包括crylAc基因和crylAb/Ac基因2種，轉(zhuǎn)cryAa基因棉花未允許在我國商業(yè)化種植，包括南農(nóng)6號。因此本研究選用非轉(zhuǎn)基因棉花、9個代表性轉(zhuǎn)基因棉花品種作為陰性對照。其中，皖棉13、中棉35、冀668、中棉所48、中棉所41、魯棉研15為國內(nèi)轉(zhuǎn)crylAc基因和crylAb/Ac基因代表性抗蟲棉品種;MON531和MON757為孟山都公司的兩個代表性轉(zhuǎn)crylAc基因棉花品種，在我國均具有不同程度的市場份額;MON1445為抗除草劑棉花品種。使用特異性引物對南農(nóng)6號及上述轉(zhuǎn)基因棉花、非轉(zhuǎn)基因棉花進行PCR擴增，結(jié)果（圖2）表明：僅南農(nóng)6號獲得了預(yù)期201bp擴增，其他轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因棉花均為陰性?？梢?，該引物能夠特異性區(qū)分出南農(nóng)6號與其他抗蟲棉品系。

2.3標準曲線的建立

為驗證構(gòu)建的質(zhì)粒分子pMD-NN6作為標準物質(zhì)用于南農(nóng)6號品系準確定量的適用性，以3X10～3X10'拷貝的7個濃度梯度的質(zhì)粒DNA作為模板，分別建立了基于南農(nóng)6號棉花品系特異性序列和棉花acpl內(nèi)標準基因序列為靶標的兩個標準曲線。標準曲線和擴增圖如圖3所示。品系特異性序列3次重復(fù)的PCR擴增效率（E）分別為0.991、0.985和0.994，相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.999、0.999和0.999，均接近于l;acpl內(nèi)標準基因序列3次重復(fù)的擴增效率分別為1.057、1.051和1.041，相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.996、0.998和0.999，也接近于1。以上結(jié)果表明，兩個定量反應(yīng)具有理想的擴增效率，模板起始拷貝數(shù)和Ct值之間具有良好的線性關(guān)系（表2），建立的兩個標準曲線可以用于南農(nóng)6號準確定量。

2.4定量方法的可重復(fù)性和檢測限

應(yīng)用建立的定量方法對3X10^～3X10'拷貝的6個濃度梯度的質(zhì)粒DNA分子進行了定量檢測，3次重復(fù)性檢測結(jié)果的可重復(fù)性標準差（SD）在0.02～0.24，相對標準差（RSD）在0.07%～0.75%，均具有較好的可重復(fù)性，表明應(yīng)用該方法可以準確定量到30個拷貝（表3）。上述結(jié)果表明，該方法適合對南農(nóng)6號的身份鑒定和準確定量，定量方法的檢測限（LOQ）為30個拷貝。

2.5定量方法的準確性和精確性

為進一步驗證定量方法的準確性和精確性，考慮到國際標識管理的需要，對2.0%和0.5%兩個已知南農(nóng)6號含量的混合樣品進行了定量檢測。校正系數(shù)Cfs（Calibrationfactors，品系序列拷貝數(shù)lacpl內(nèi)標準基因拷貝數(shù)）用以校正質(zhì)粒DNA和植物基因組DNA在PCR效率等方面存在的差異而導(dǎo)致定量結(jié)果存在的偏差。Cfs值的確定以南農(nóng)6號基因組DNA.作為模板，測定結(jié)果平均Gfs值為0.95（表4）。由公式：樣品轉(zhuǎn)基因含量=外源目的基因的拷貝數(shù)/內(nèi)標準基因的拷貝數(shù)X100%XCfs計算出兩個混合樣品中外源DNA的含量如表5所示，2.0%含量的平均定量檢測值是1.96%，0.5%含量的平均定量檢測值是0.45%。實際測定值和真實值之間的準確度標準偏差（bias）分別為-2.03%和-9.17%，精確度標準差（SD）分別為0.07和0.04，相對標準差（RSD）分別為3.44%和9.04%，均低于土25%可接受值。根據(jù)定量PCR反應(yīng)的校正系數(shù)（Cfs）可知，南農(nóng)6號基因組DNA中品系特異性序列和acpl內(nèi)標準基因的拷貝數(shù)之比為0.95，接近1，因此測定的2.0%和0.5%兩個不同轉(zhuǎn)基因含量和質(zhì)量百分比含量是一致的。實際上，國際標識管理規(guī)定的是轉(zhuǎn)基因含量檢測范圍為5.0%～0.9%。因此，0.5%含量可以滿足轉(zhuǎn)基因定量檢測的要求，表明質(zhì)粒分子pMD-NN6可以代替基因組DNA作為定量標準品，建立快速、準確的南農(nóng)6號實時熒光定量PCR方法，以便實時監(jiān)測南農(nóng)6號棉花的非法種植。

3討論

在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域，作為定性檢測的陽性對照和定量標準品，質(zhì)粒DNA分子替代基因組DNA應(yīng)用越來越普遍。特別是通過人工插入多個靶標序列，從而實現(xiàn)對高通量檢測，廣泛應(yīng)用于水稻、玉米、棉花、大豆等作物的轉(zhuǎn)基因檢測。與基因組DNA作為標準品相比，質(zhì)粒分子純度高，具有更低的檢測限41618本研究建立的定量方法用于轉(zhuǎn)crylAa基因棉花南農(nóng)6號可以檢測到30拷貝，和楊陽等.H報道的基因組DNA作為標準品檢測限44個拷貝相比，具有更高的檢測靈敏度。

標準物質(zhì)作為一類具有嚴格賦值的用于對其他物質(zhì)進行定量，或?qū)z測方法進行評價的物質(zhì)，其計量的標準化對于轉(zhuǎn)基因檢測的準確性、可靠性和有效性至關(guān)重要。目前，真正能夠溯源的有證標準物質(zhì)并不多，質(zhì)粒分子有證標準物質(zhì)更是僅限于轉(zhuǎn)基因玉米MON810、NK603、98140等幾種轉(zhuǎn)化體。作為全球廣泛種植的轉(zhuǎn)基因棉花，目前尚無可用于檢測的質(zhì)粒分子有證標準物質(zhì)，因此質(zhì)粒分子標準物質(zhì)的研制是非常必要的。本研究構(gòu)建的質(zhì)粒分子pMD-NN6建立的定量方法均滿足國際相關(guān)標準的要求，如定量標準曲線的擴增效率（E）和相關(guān)系數(shù)（r）接近1，混合樣品定量準確度標準偏差（bias）、精確度標準差（SD）和相對標準差（RSD）均《25%。本研究結(jié)果一方面可以對轉(zhuǎn)crylAa基因棉花南農(nóng).6號進行特異性檢測和準確定量，以便實時監(jiān)測其非法種植;另一方面可以為轉(zhuǎn)基因棉花質(zhì)粒分子標準物質(zhì)的研制提供參考數(shù)據(jù)。

另外，南農(nóng)6號基因組DNA中品系特異性序列和acpl內(nèi)標準基因的拷貝數(shù)之比為1：1，已知acpl內(nèi)標準基因在棉花基因組中的拷貝數(shù)為2拷貝，據(jù)此推測南農(nóng)6號品系特異性序列在棉花基因組DNA中應(yīng)為2個拷貝，這一結(jié)果也進一步驗證了利用質(zhì)粒分子可以用來確定外源基因拷貝數(shù)的應(yīng)用么，但還需要通過其他的，如sourthern雜交等方法進行確證。

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（責(zé)任編輯：楊小萍）

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