杭小英 于喆 呂孫建

摘要：從3個(gè)日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）養(yǎng)殖池塘的水體、蝦中分離得到41個(gè)菌株，經(jīng)16S rDNA基因序列分析，結(jié)合菌落形態(tài)觀察，水體分離到的菌株初步鑒定為芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬等，蝦肝胰腺中分離的菌株初步鑒定為氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌科等。采用滴注法檢測(cè)了噬菌體NTHP01對(duì)分離到的細(xì)菌的抑菌效果，結(jié)果表明，噬菌體NTHP01對(duì)芽孢桿菌、氣單胞菌、不動(dòng)桿菌、腸桿菌、檸檬酸桿菌、原生節(jié)桿菌、鄰單胞菌、格氏乳球菌等均具有較好的裂解作用。將噬菌體NTHP01制劑在日本沼蝦養(yǎng)殖塘進(jìn)行示范應(yīng)用，初步結(jié)果表明日本沼蝦產(chǎn)量提高338～412 kg/hm2，產(chǎn)值提高2.25萬～3.00萬元/hm2。

關(guān)鍵詞：噬菌體;日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）;細(xì)菌性疾病;防治

中圖分類號(hào)：S945.1 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）17-0097-04

Abstract： 41 bacterial strains were isolated from water and shrimps of three Macrobrachium nipponense ponds， by 16S rDNA gene sequence analysis and colony morphology observation， the strains from water were preliminarily identified as Bacillus megaterium， Aeromonas caviae， Enterobacter roggenkampii，et al， the strains from shrimp were preliminarily identified as Aeromonas caviae， Citrobacter murliniae， Enterobacter roggenkampii， et al. The phage NTHP01 inhibition of bacteria was detected by drop injection methodthe results showed that， phage NTHP01 had good cracking effect on Bacillus， Aeromonas， Acinetobacter， Enterobacter， Citrobacter， Arthrobacter protophormiae， Orthomonad， Lactococcus garvieae， et al. Phage NTHP01 preparation was appliled in shrimp breeding pond， the preliminary results showed that， the yield of Macrobrachium nipponense increased by 338～412 kg/hm2， and the output value increased by 2.25 ten thousand ～3.00 ten thousand yuan/hm2.

Key words： phage; Macrobrachium nipponense; bacterial diseases; control

日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）俗稱河蝦、青蝦，隸屬于十足目（Decapoda）長(zhǎng)臂蝦科（Palaemonidae）沼蝦屬（Macrobrachium）。據(jù)漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)，2016年中國(guó)日本沼蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量已達(dá)到27.26萬t[1]，是中國(guó)產(chǎn)量較高的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類之一。日本沼蝦肉質(zhì)鮮嫩、口感細(xì)膩，在上海、浙江、江蘇等地廣受消費(fèi)者的歡迎。目前日本沼蝦養(yǎng)殖過程中，最大的不利因素仍然是病害，養(yǎng)殖管理中稍有疏忽，極易暴發(fā)紅體病、弧菌病、軟殼癥等細(xì)菌性疾病，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。養(yǎng)殖戶通常采用化學(xué)藥物和抗生素進(jìn)行養(yǎng)殖環(huán)境的改善和病害的控制，但化學(xué)藥物的使用易對(duì)生態(tài)環(huán)境造成不良影響，抗生素的長(zhǎng)期使用也會(huì)帶來細(xì)菌耐藥性、抗生素殘留等負(fù)面影響。為了保護(hù)生態(tài)環(huán)境，提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全水平，抗生素替代藥物的研發(fā)顯得尤為重要。而噬菌體是一種可入侵細(xì)菌內(nèi)繁殖，最終使細(xì)菌裂解的病毒，它可以“殺死”宿主菌，達(dá)到預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病的目的，又與細(xì)菌耐藥性無關(guān)，是一種很有應(yīng)用前景的抗生素替代療法。農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從中華鱉養(yǎng)殖塘中分離純化獲得1株噬菌體（NTHP01），前期已開展了生理特征和噬菌作用研究，為進(jìn)一步拓展噬菌體在日本沼蝦養(yǎng)殖中常見的細(xì)菌性疾病的防治作用，本研究開展噬菌體對(duì)日本沼蝦養(yǎng)殖塘中分離細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)，并在生產(chǎn)中示范應(yīng)用，為后續(xù)在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 日本沼蝦、水樣 試驗(yàn)用的日本沼蝦、水樣來自浙江省德清縣下渚湖街道塘涇村、雙橋村的3個(gè)日本沼蝦養(yǎng)殖場(chǎng)。每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)選擇1個(gè)養(yǎng)殖塘，各隨機(jī)采日本沼蝦樣品20余只，用采水器采集池塘近底層水樣1瓶。

1.1.2 噬菌體 從中華鱉養(yǎng)殖塘分離得到的氣單胞菌噬菌體（NTHP01），保存于農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基 從日本沼蝦、池塘水樣中分離、培養(yǎng)細(xì)菌使用TCBS、TSA液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離 日本沼蝦取肝胰腺，研磨勻漿，稀釋10倍后取50 μL涂布于TCBS、TSA平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h;水樣稀釋10倍后取 ? ? 100 μL涂布于TCBS、TSA平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。觀察平板上生長(zhǎng)的菌落，根據(jù)菌落特征不同，分別挑取單個(gè)菌落接種于TSB試管中，30 ℃搖床培養(yǎng)18 h。

1.2.2 分離菌株的鑒定 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株的DNA，將其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用通用引物：27f：AGAGTTTGATCATGGCTCAG，1492r：GGTACCTTGTTACGACTT進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增，擴(kuò)增體系50 μL：10×buffer ? ? ?5 μL，dNTPs 8 μL，1.5 mmol/L MgCl2 4 μL，PrimerF ?1 μL，PrimerR 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，模板DNA 2 μL，dd H2O 28.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s、55 ℃復(fù)性1 min、72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃溫浴10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將序列與NCBI開放數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST在線比對(duì)分析同源性，初步得出鑒定結(jié)果。

1.2.3 噬菌體抑菌效果試驗(yàn) 分離得到的菌株采用TSB液培養(yǎng)基，30 ℃搖床培養(yǎng)18 h，通過分光光度計(jì)測(cè)OD值，將菌液調(diào)整成合適的濃度（OD600 nm 1.0左右）;取適量實(shí)驗(yàn)室保存的噬菌體（NTHP01）液，離心取上清液，濾膜過濾。采用滴注法觀察噬菌體的噬菌效果。各取菌液100 μL均勻涂布于整個(gè)平板，待平板表面風(fēng)干3～5 min后，再在平板上滴加5 μL噬菌體液，30 ℃培養(yǎng)8～12 h觀察噬菌效果。

1.2.4 噬菌體的示范應(yīng)用 在浙江省德清縣下渚湖街道塘涇村一日本沼蝦養(yǎng)殖塘開展噬菌體制劑的示范應(yīng)用。養(yǎng)殖塘面積約0.33 hm2，2018年7月5日放苗，放養(yǎng)密度為180萬尾/hm2，7月30日開始使用噬菌體制劑，以2%～3%添加在飼料中拌勻投喂，每天投喂1次，按照連續(xù)投喂3 d—停喂5 d—投喂3 d的規(guī)程進(jìn)行預(yù)防，如發(fā)現(xiàn)病害則加大使用劑量和頻率;對(duì)照養(yǎng)殖塘不使用噬菌體制劑，傳統(tǒng)模式管理。10月初開始陸續(xù)捕獲商品蝦，統(tǒng)計(jì)養(yǎng)殖產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離純化及鑒定結(jié)果

從日本沼蝦養(yǎng)殖塘的水樣中共分離到21個(gè)菌株（表1），經(jīng)16S rDNA基因序列分析，結(jié)合菌落形態(tài)觀察，初步鑒定為芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬等;從日本沼蝦肝胰腺中共分離到20個(gè)菌株（表2），經(jīng)16S rDNA基因序列分析，結(jié)合菌落形態(tài)觀察，初步鑒定為氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌科等。

2.2 噬菌體對(duì)日本沼蝦養(yǎng)殖環(huán)境中常見細(xì)菌的噬菌作用

對(duì)從青蝦養(yǎng)殖塘水體和青蝦中分離到的41個(gè)菌株進(jìn)行噬菌體噬菌試驗(yàn)，結(jié)果表明噬菌體NTHP01對(duì)芽孢桿菌、氣單胞菌、不動(dòng)桿菌、腸桿菌、檸檬酸桿菌、原生節(jié)桿菌、鄰單胞菌、格氏乳球菌等均具有較好的裂解作用（表1、表2）。

2.3 噬菌體的示范應(yīng)用效果

在浙江省德清縣下渚湖街道塘涇村一日本沼蝦養(yǎng)殖塘開展噬菌體制劑的示范應(yīng)用，經(jīng)過一個(gè)養(yǎng)殖周期的應(yīng)用，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量約為1 050 kg/hm2，產(chǎn)值12.00萬～15.00萬元/hm2;對(duì)照養(yǎng)殖塘由于發(fā)病等原因，產(chǎn)量很低，只有300～375 kg/hm2。與往年比較使用噬菌體的養(yǎng)殖塘產(chǎn)量至少增加338～412 kg/hm2，產(chǎn)值提高2.25萬～3.00萬元/hm2，且消毒劑和其他藥物的使用量大大減少，示范效果良好。

3 小結(jié)與討論

3.1 日本沼蝦養(yǎng)殖中常見的細(xì)菌性病害

日本沼蝦養(yǎng)殖中常見的細(xì)菌性疾病有紅體病、爛鰓病、弧菌病、黑斑病、軟殼癥等[2]。葉雪平等[3]從患紅體綜合征（紅體、紅頭）的青蝦肝胰腺和肌肉中分離到菌株，經(jīng)生理生化分析、藥物敏感及感染試驗(yàn)等，鑒定為擬態(tài)弧菌。沈錦玉等[4]、薛暉等[5]從患紅鰓病、紅體病青蝦的肝、肌肉、鰓中分離到菌株，均鑒定為嗜水氣單胞菌 。潘曉藝等[6]從患軟殼綜合征的瀕死青蝦體內(nèi)分離到一株細(xì)菌，經(jīng)API32E系統(tǒng)鑒定及16S rRNA序列分析， 確定該病原菌為維羅納氣單胞菌溫和生物變種，與維羅納氣單胞菌和維羅納氣單胞菌溫和生物變種的同源性都為99%。本研究采樣的日本沼蝦池塘雖然沒有發(fā)病，但從養(yǎng)殖水體、日本沼蝦體內(nèi)均分離到大量菌株，經(jīng)鑒定為氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌科等，都是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的致病菌，尤其氣單胞菌屬中的嗜水氣單胞菌在一定條件下可引起青蝦紅體病，該病傳染性強(qiáng)、發(fā)病面廣、死亡率高[2， 3， 5]，危害很大。

3.2 噬菌體對(duì)病原菌的抑制作用

噬菌體以細(xì)菌為宿主，可以特異性地殺滅相應(yīng)的宿主菌，是一種天然的抗菌生物制劑，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌有裂解作用，特別對(duì)具有多重耐藥性的病原菌都有較好的裂解效果[7-9]。Karunasagar等[10]從牡蠣組織和蝦孵化場(chǎng)分離得到2個(gè)噬菌體，可以有效降低哈維氏菌群。Jun等[11]分離出2個(gè)噬菌體，發(fā)現(xiàn)對(duì)魚類致病性嗜水氣單胞菌均顯示出有效的溶菌活性。本研究將從日本沼蝦養(yǎng)殖塘水體和日本沼蝦中分離到的41個(gè)菌株進(jìn)行噬菌體噬菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)噬菌體NTHP01對(duì)芽孢桿菌、氣單胞菌、不動(dòng)桿菌、腸桿菌、檸檬酸桿菌、原生節(jié)桿菌、鄰單胞菌、格氏乳球菌等均具有較好的裂解作用，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曾于2019年對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的致病菌進(jìn)行體外噬菌試驗(yàn)[12]，結(jié)果表明，噬菌體對(duì)嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、副溶血弧菌、維氏氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌等均有較好的裂解效果。

3.3 噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的運(yùn)用

目前，噬菌體已成功應(yīng)用于食源性致病微生物的防治，關(guān)于噬菌體在水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性病害防控中的應(yīng)用試驗(yàn)，國(guó)外科學(xué)家開展的研究比較多，用于治療嗜水氣單胞菌引起的泥鰍出血性敗血病、哈維弧菌引起的斑節(jié)對(duì)蝦發(fā)光弧菌病、對(duì)蝦副溶血弧菌病、海參燦爛弧菌病等，均效果明顯[13-15]。Le等[16]分離獲得了2株嗜水氣單胞菌噬菌體，應(yīng)用在嗜水氣單胞菌引起的條紋鯰大量死亡的有效性試驗(yàn)中，該噬菌體的保護(hù)率可達(dá)到100%，對(duì)照組的存活率僅18.3%。本研究將噬菌體應(yīng)用在日本沼蝦養(yǎng)殖中，按一定比例拌在飼料中定期投喂，初步的結(jié)果表明可降低日本沼蝦發(fā)病率，跟對(duì)照養(yǎng)殖塘相比產(chǎn)量提高338～412 kg/hm2，增加經(jīng)濟(jì)效益2.25萬～3.00萬元/hm2。

綜上所述，噬菌體對(duì)日本沼蝦常見病害的病原菌具有較好的抑制作用，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用效果明顯。此外，噬菌體抑菌的作用機(jī)理是通過感染-繁殖-裂解循環(huán)周期殺滅細(xì)菌，與細(xì)菌是否耐藥無關(guān)，而且特異性強(qiáng)，除對(duì)宿主菌外的其他細(xì)菌無殺傷力，對(duì)機(jī)體的正常菌群基本無影響，對(duì)人體、動(dòng)植物、環(huán)境無任何毒副作用。噬菌體制劑對(duì)今后發(fā)展成水產(chǎn)養(yǎng)殖中的抗生素替代制劑具有很好的應(yīng)用前景。

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