朱志強(qiáng) 童文羽 曾智

摘要：孔雀石綠是一種合成的三苯基甲烷類(lèi)工業(yè)染料，曾被作為殺蟲(chóng)劑和殺菌劑廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量檢測(cè)的國(guó)標(biāo)方法GB/T 20361—2006在多年檢測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)有操作繁瑣、回收率和精密度較差的缺點(diǎn)。試驗(yàn)比較了不同提取次數(shù)和凈化次數(shù)對(duì)回收率的影響，改進(jìn)了GB/T 20361—2006的前處理和色譜條件，減少提取次數(shù)和凈化操作，降低了流速。改進(jìn)后方法檢測(cè)限為0.40 μg/kg，回收率提升至81.8%～100.8%，精密度為0.93%～8.32%，均達(dá)到并優(yōu)于國(guó)標(biāo)。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)品;孔雀石綠;高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：TS254.7 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）17-0150-04

Abstract： Malachite green， as a synthetic industrial dye of triphenylmethane， has been widely used in aquaculture as an insecticide and fungicide. GB/T20361—2006 for the detection of malachite green residues in aquatic products was found that had some disadvantages， such as tedious operation， poor recovery and precision during years of testing. The effects of different extraction times and purification times on the recovery rate， and improved the pretreatment and chromatographic conditions of GB/T20361—2006，reducing the number of extractions and purification operations reduces the flow rate of the chromatographic method. The improved method has a detection limit of 0.40 μg/kg， a recovery rate of 81.8%～100.8%， and a precision of 0.93%～8.32%， which all meet and exceed the national standard.

Key words： aquatic products; malachite green; HPLC

孔雀石綠（Malachite green，MG）又名苯胺綠、堿性孔雀石綠、品綠、鹽基塊綠，是一種合成的三苯基甲烷類(lèi)工業(yè)染料，被廣泛用于制陶業(yè)、紡織業(yè)和皮革業(yè)。在20世紀(jì)30年代被廣泛用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的殺蟲(chóng)劑和殺菌劑，用來(lái)殺滅體外寄生蟲(chóng)和魚(yú)卵中的霉菌[1]。但研究發(fā)現(xiàn)，MG的三苯甲烷結(jié)構(gòu)可致癌，在魚(yú)體脂肪組織中多以隱色孔雀石綠（Leucomalachite green，LMG）（圖1）形態(tài)長(zhǎng)期殘留，可通過(guò)食物鏈對(duì)哺乳動(dòng)物和人類(lèi)產(chǎn)生致畸、致癌、致突變等作用[2-4]。2002年MG就被列入《食品動(dòng)物禁用獸藥及其化合物清單》中，2005年7月7日，原農(nóng)業(yè)部下發(fā)《關(guān)于組織查處孔雀石綠等禁用獸藥的緊急通知》，隨后，原國(guó)家質(zhì)檢總局、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委發(fā)布GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》規(guī)定了水產(chǎn)品中MG及LMG的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和高效液相色譜的測(cè)定方法，其中規(guī)定MG在水產(chǎn)品的檢出濃度不得超過(guò)1.0 μg/kg。

目前，水產(chǎn)品中MG主流定量方法主要包括液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺點(diǎn)易受干擾，對(duì)人員和實(shí)驗(yàn)室硬件要求高，檢測(cè)費(fèi)用昂貴。液相色譜法中的GB/T 19857—2005[5]經(jīng)氧化鉛柱后衍生法操作繁瑣，檢出限較高，孔雀石綠（MG）與隱色孔雀石綠（LMG）檢出限均為2 μg/kg，不能滿足檢測(cè)要求。GB/T 20361—2006[6]方法檢出限為0.5 μg/kg，定性定量都較為準(zhǔn)確，成為使用廣泛的檢測(cè)方法。該方法的缺點(diǎn)是操作較為繁瑣，回收率不穩(wěn)定，精密度較低。孫協(xié)軍等[7]、王陳園等[8]改進(jìn)后前處理步驟還是較為繁瑣，劉少彬等[9]建立了超高效液相色譜法快速測(cè)定水產(chǎn)品中的MG和結(jié)晶紫方法，但該法對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件要求也較高。為此，本研究圍繞改進(jìn)現(xiàn)有方法GB/T 20361—2006的不足，通過(guò)優(yōu)化前處理的提取、凈化操作，提高回收率和精密度，為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督抽查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：草魚(yú)、加州鱸魚(yú)、對(duì)蝦，樣品來(lái)源于某基地和市場(chǎng)。

試劑及耗材：MG（99.0%）和LMG（99.6%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer公司;酸性氧化鋁及PRS固相萃取柱（3 mL，500 mg，bond Elut）購(gòu)于安捷倫科技有限公司。分析純酸性氧化鋁、硼氫化鉀、乙腈、乙酸銨、對(duì)甲苯磺酸、鹽酸羥胺（氯化羥胺）均購(gòu)于國(guó)藥試劑公司，色譜純乙腈和甲酸購(gòu)于默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 主要儀器

液相色譜儀為島津LC-20AD高效液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器RF-20A， LC Solution工作站;Waters e2695高效液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器2475，Empower 3工作站;色譜柱為T(mén)hermo Acclaim C18與安捷倫ZORBAX SB-C18，規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，5 μm。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別稱取MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g，用色譜純級(jí)乙腈溶解，必要時(shí)使用超聲波助融，定容至100 mL棕色容量瓶中，-18 ℃保存，有效期6個(gè)月，LMG標(biāo)準(zhǔn)品從固體溶解為液體需要加入極少量硼氫化鉀以防止被氧化為MG，由于硼氫化鉀不溶于純乙腈，因此還需要加入少量超純水。混合標(biāo)準(zhǔn)中間液使用乙腈稀釋并用棕色容量瓶盛裝，有效期3個(gè)月，上機(jī)使用的標(biāo)準(zhǔn)工作液使用乙腈稀釋?zhuān)F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品制備 魚(yú)去鱗，沿背脊取可食肌肉部分，蝦去頭、殼，取可食肌肉部分，切為小塊，絞成魚(yú)糜或蝦糜，經(jīng)GB/T 19857—2005液質(zhì)法檢測(cè)確認(rèn)陰性，待用。

1.3.3 提取 稱?。?.00±0.01） g魚(yú)糜于50 mL離心管中，加入5.00 g酸性氧化鋁和10 mL乙腈，振蕩1 min，超聲5 min，4 500 r/min離心5 min，將上清液倒入250 mL分液漏斗中;離心管中繼續(xù)加入 ? ?10 mL乙腈，3 mL 0.2 mol/L硼氫化鉀，振蕩1 min，超聲5 min，4 500 r/min離心5 min，上清液倒入 ? 250 mL分液漏斗中;離心管中繼續(xù)加入10 mL乙腈、1.5 mL 20%鹽酸羥胺、5 mL 濃度為0.125 mol/L乙酸銨緩沖液、10 mL乙腈，振蕩1 min，超聲5 min， ? 4 500 r/min離心5 min，上清液倒入250 mL分液漏斗中。往分液漏斗中加入3 mL 0.2 mol/L硼氫化鉀、2 mL二甘醇、20 mL二氯甲烷，蓋塞，劇烈振搖1 min，靜置分層，下層液體轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，45 ℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾至近干。

1.3.4 凈化 將PRS柱安裝在固相萃取裝置上，上端連接酸性氧化鋁小柱，下端連接PRS小柱，5 mL乙腈活化。雞心瓶中加入2.5 mL乙腈溶解殘?jiān)瑢⒁译孓D(zhuǎn)移至萃取小柱上，依次過(guò)柱，再用乙腈清洗雞心瓶2次，每次2.5 mL，依次過(guò)柱，棄去氧化鋁小柱，在不抽真空的情況下，吹PRS柱至近干，然后加入3 mL等體積混合的乙腈和0.1 mol/L乙酸銨緩沖液洗脫，收集洗脫液，乙腈定容至3.0 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，供液相色譜測(cè)定。

1.3.5 色譜條件 色譜柱Thermo Acclaim C18、安捷倫ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm;柱溫35 ℃，流動(dòng)相為乙腈∶0.125 mol/L乙酸銨緩沖液（9.64 g乙酸銨溶于1 L水，乙酸調(diào)pH為4.5）=80∶20，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，激發(fā)波長(zhǎng)265 nm，發(fā)射波長(zhǎng)360 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

在草魚(yú)、加州鱸魚(yú)、對(duì)蝦陰性樣品中分別添加MG和LMG，添加濃度分別為0.5、1.5、2.5 μg/kg，每個(gè)添加水平設(shè)6個(gè)平行樣。加標(biāo)后按照“1.3.3”的方法提取、“1.3.4”的方法凈化，在“1.3.5”色譜條件下上機(jī)分析，根據(jù)色譜圖各組分的峰面積，計(jì)算相應(yīng)加標(biāo)濃度的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），加標(biāo)回收結(jié)果見(jiàn)表1。陰性樣品色譜見(jiàn)圖2，LMG加標(biāo)色譜見(jiàn)圖3，MG加標(biāo)色譜見(jiàn)圖4。

配制濃度為1、2、4、16、30、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“1.3.5”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到濃度（μg/L）與峰面積線性回歸方程為y=2.977 3×105x+4.375 2×102，R2 =0.999 3，在1～100 μg/L線性良好。按信噪比S/N≥3為檢測(cè)限，測(cè)得檢測(cè)限為0.40 μg/kg。

2.2 前處理優(yōu)化

按照GB/T 19857—2005[5]、GB/T 20361—2006[6]的提取方法稱取5.00 g已絞碎樣品至離心管中，加入提取劑超聲提取后再勻漿提取。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于提取劑中主要成分是乙腈，能使樣品中蛋白質(zhì)變性，粘在勻漿機(jī)刀頭上，即便多次洗刀頭也很難洗凈，尤其在蛋白質(zhì)含量豐富的蝦樣前處理過(guò)程中特別嚴(yán)重。多次清洗刀頭、勻漿過(guò)程中提取劑飛濺損失，都會(huì)嚴(yán)重影響回收率[10]。因此，將勻漿提取改為超聲提取。

按照GB/T 20361—2006的方法共提取了4次，提取3次MG和LMG回收率為80%～90%;提取第4次時(shí)在液液萃取凈化出現(xiàn)有機(jī)相和水相混溶、倒置，造成回收率低，平行極差，回收率相對(duì)前3次反而降低，甚至無(wú)法檢出。劉少彬等[9]提出僅提取2次的前處理方法回收率在84.4%～98.4%，滿足檢測(cè)要求。但該方法省去了液液萃取步驟，需要真空濃縮，不能使用普通的減壓旋蒸儀，對(duì)硬件要求較高。本試驗(yàn)加標(biāo)回收發(fā)現(xiàn)，提取2次的提取回收率為42.0%～71.0%，明顯低于提取3次的81.6%～93.8%，不能滿足檢測(cè)要求，因此，選擇提取3次（表2）。

按照GB/T 20361—2006的方法使用二氯甲烷液液萃取凈化2次，實(shí)際操作中，因?yàn)闃悠分兄镜入s質(zhì)影響，第2次萃取過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)乳化分層困難、有機(jī)相和水相混溶、倒置現(xiàn)象[11]，直接影響下一步旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾，嚴(yán)重影響回收率和圖譜基線（圖5）。相比使用改進(jìn)后方法（圖3、圖4），可以看出圖5不同樣品的基線和峰面積波動(dòng)較大，直接影響檢測(cè)結(jié)果。但如果不采用液液萃取分離水相和有機(jī)相，直接旋蒸濃縮提取劑，因提取劑中水分含量高，旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾時(shí)特別容易出現(xiàn)爆沸。如果采取氮吹濃縮，因?yàn)樘崛┝刻?，提取劑大部分為乙腈且含水量高，耗時(shí)太長(zhǎng)（至少1 h）且很難吹干。該方法只使用20 mL二氯甲烷液液萃取1次，節(jié)約了時(shí)間，避免因萃取水相和有機(jī)相分層困難、混溶、倒置造成的回收率損失。

2.3 儀器方法的優(yōu)化

GB/T 20361—2006的方法流速為1.3 mL/min，容易造成色譜基線不穩(wěn)定，影響目標(biāo)物質(zhì)的積分與定量（圖5、圖6）。改為1.0 mL/min后色譜基線相對(duì)平穩(wěn)，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的積分影響較?。▓D7）。

3 小結(jié)與討論

比較了國(guó)標(biāo)方法GB/T 20361—2006中孔雀石綠殘留量不同提取次數(shù)和凈化次數(shù)對(duì)回收率的影響，優(yōu)化了前處理和色譜條件，將原方法提取4次、液液萃取凈化2次的前處理操作減少為提取3次凈化1次，同時(shí)將色譜方法的流速?gòu)?.3 mL/min降低為1.0 mL/min，節(jié)省了前處理時(shí)間和試劑用量，提高了檢測(cè)效率，降低了基質(zhì)干擾，避免了原方法液液萃取造成的提取劑乳化、分層困難和回收率、精密度偏低的情況，同時(shí)使色譜基線更加穩(wěn)定，對(duì)目標(biāo)峰積分的影響更小。改進(jìn)后方法檢測(cè)限由原國(guó)標(biāo)方法的0.50 μg/kg降低為0.40 μg/kg，回收率由原國(guó)標(biāo)方法的70%～110%提升至81.8%～100.8%，精密度達(dá)到0.93%～8.32%，均達(dá)到并優(yōu)于國(guó)標(biāo)，值得普及推廣。

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