魏瑞奇,樸春梅,張文美,朱光發(fā)*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,北京 100029;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院北京市心肺血管疾病研究所,北京 100029)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是一種進(jìn)行性加重的致命性疾病,其主要特征是肺血管重構(gòu)和肺血管阻力進(jìn)行性增高,最終引起右心功能衰竭甚至死亡[1]。 PH 的發(fā)生發(fā)展過程與肺血管結(jié)構(gòu)和功能異常密切相關(guān),肺血管床內(nèi)膜損傷、中層肥厚、外膜增殖、纖維化導(dǎo)致肺動(dòng)脈管腔進(jìn)行性狹窄、閉塞,肺血管阻力不斷升高,但PH 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[2]。 因此,利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立PH 動(dòng)物模型在PH 機(jī)制研究中必不可少,常用的PH 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要是大鼠和小鼠,其中小鼠由于便于飼養(yǎng),繁殖能力強(qiáng),背景清晰,同時(shí)目前用于PH 基礎(chǔ)研究的基因工程動(dòng)物主要是小鼠來源[3],因此小鼠PH 模型制備和應(yīng)用極其重要。

評(píng)估PH 動(dòng)物模型最主要的指標(biāo)就是血流動(dòng)力學(xué)的測(cè)定,因此建立一個(gè)快速、準(zhǔn)確的評(píng)估肺血管及右心室血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)的方法,是目前該領(lǐng)域亟待解決的問題。 研究表明,在沒有肺動(dòng)脈瓣疾病的情況下,右心室收縮壓可用來評(píng)估肺動(dòng)脈收縮壓的高低[4],目前常用測(cè)定方法有主要有經(jīng)頸外靜脈右心導(dǎo)管術(shù)[5-6]、經(jīng)頸外靜脈導(dǎo)絲引導(dǎo)右心導(dǎo)管法[7]、呼吸機(jī)輔助開胸直視下穿刺法[8]、開腹經(jīng)膈肌穿刺右心室法[9]、經(jīng)胸壁右心室盲穿法[10]等,這些方法主要應(yīng)用于大鼠。 小鼠的測(cè)定方法主要有開胸法[11]、右心導(dǎo)管法等[12-13]。 相較大鼠而言,小鼠重量僅為大鼠的1/10,血管細(xì),心臟小,右心導(dǎo)管操作困難,成本高且耗時(shí),成功率低[11]。 呼吸機(jī)輔助的開胸直視穿刺檢測(cè)需要連接呼吸機(jī)和氣管插管,且暴露胸腔所造成的人為氣胸改變了小鼠生理狀態(tài)下的心臟所處的密閉環(huán)境,可能對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的影響。 最近高陽等[14]PH 模型小鼠采用閉胸右心室穿刺法檢測(cè)小鼠右心室收縮壓,但未描述具體操作方法和步驟。 本研究旨在采用一種經(jīng)肋間肌穿刺法測(cè)定肺動(dòng)脈高壓小鼠模型右心室壓力的實(shí)驗(yàn)方法,保持動(dòng)物胸腔密閉無需呼吸機(jī)輔助呼吸,使操作便捷高效,介紹如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 J 小鼠23 只,8～10 周齡,體重(20 ± 3)g,購自北京唯尚立拓科技有限公司[SCXK(京) 2016-0009],低氧組11 只,對(duì)照組12 只飼養(yǎng)于北京市心肺血管疾病研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)(濕度40%～70%,溫度16℃～26℃)[SYXK (京) 2016-0027]。 本研究實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京安貞醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)過程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求的3R 原則(減少、替代、優(yōu)化),并給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

動(dòng)物低氧艙(加拿大Optoprobe Research 公司)、Power Lab4/30 多導(dǎo)生理儀(ML866,澳大利亞埃德儀器國際貿(mào)易有限公司)、Lab Chart 軟件、冷光源(MODEL C-F1230,日本Nikon 公司)、電子天平(JA2003,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、壓力換能器探頭及三通管、0.6 mm×25 mm 一次性輸液器針頭(S2D2S,江西科倫醫(yī)療器械制造有限公司)、10 mL 及1 mL 注射器、1%戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)、0.9%生理鹽水、酒精噴壺、自制小鼠固定板、醫(yī)用膠帶、眼科鑷、眼科剪、醫(yī)用棉球等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制備肺動(dòng)脈高壓小鼠模型

23 只小鼠進(jìn)行完全隨機(jī)分組,對(duì)照組12 只,低氧組11 只。 低氧組小鼠在密閉的低氧艙里飼養(yǎng)4周,誘導(dǎo)形成肺動(dòng)脈高壓,其中低氧艙內(nèi)24 h 持續(xù)泵入空氣和氮?dú)獾某夯旌蠚怏w,通過氧氣監(jiān)測(cè)控制系統(tǒng)監(jiān)測(cè),保證低氧艙內(nèi)氧濃度控制在(10±0.5)%,CO2濃度低于0.5%。 對(duì)照組小鼠在正?？諝庵酗曫B(yǎng)4 周,其它條件相同。

1.3.2 測(cè)定右心室壓力的步驟

(1)稱重、麻醉及固定:稱重記錄,根據(jù)小鼠體重,按照10 μL/g 劑量給小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉溶液(0.9%生理鹽水配制)進(jìn)行麻醉,待小鼠肌張力消失、刺激無反應(yīng)時(shí)將其四肢用膠帶固定于自制的泡沫塑料鼠板上(圖1-1),注意避免使小鼠四肢過度拉伸,以防止對(duì)胸腔壓力產(chǎn)生影響。

(2)實(shí)驗(yàn)儀器調(diào)試:多導(dǎo)生理儀連接電腦、壓力換能器探頭及三通管,三通管的另外兩頭接輸液器針頭和裝有肝素生理鹽水的10 mL 注射器,反復(fù)調(diào)整將肝素生理鹽水充滿整個(gè)通道,不要留有氣泡,打開Lab Chart 軟件的RVP 模塊,壓力基線調(diào)零。

(3)剪開胸前皮膚:小鼠切口部位用75%酒精消毒(圖1-2),用鑷子將小鼠劍突下的皮膚提起,剪開一小口,沿胸骨正中線將小口直到頸部的皮膚剪開(圖1-3、圖1-4),并在左側(cè)肋緣下剪一斜行的切口,提起兩側(cè)的皮膚切口,輕輕向兩側(cè)撕開,注意動(dòng)作輕柔,防止皮下血管破裂出血。 此時(shí)可以看到小鼠左側(cè)胸大肌清晰的暴露出來,大致呈一直角三角形(圖1-5)。

(4)鈍性分離胸肌:用眼科鑷將小鼠胸大肌從下緣游離端緊貼胸骨左緣鈍性分離(圖1-6),分離后鑷子垂直提起胸大肌可見其下覆蓋的胸小肌,右手持鑷輕提提胸小肌內(nèi)側(cè)緣,左手再拿一鑷子鈍性分離胸小肌,并且將胸小肌從下至上撐開(圖1-7)。

(5)暴露左胸壁肋間隙:將鈍性分離好的胸大肌用剪刀沿胸骨附著處剪開并上翻,若有少量滲血,可用棉球擦去,以保持術(shù)中視野清晰,同理胸小肌也沿肋弓外下緣剪開并上翻,即可暴露看到小鼠左胸肋骨及肋間隙(圖1-8)。

(6)判斷心臟位置:透過燈光可見第三、四肋間小鼠心臟快速的搏動(dòng),可大致判斷出心臟的輪廓,搏動(dòng)最明顯處為心尖,通常位于第四肋間隙,心尖偏右上方處搏動(dòng)較心尖處稍弱的部位就是右心室。術(shù)者左手大拇指在劍突下向上推擠心臟,同時(shí)中指向右輕推胸壁,使心臟緊貼左胸前壁并固定(圖1-9),同時(shí)右手持針快速穿刺。

(7)右室穿刺點(diǎn)的確定:通過(6)確定右心室搏動(dòng)位置后,選擇左側(cè)第四肋肋角內(nèi)側(cè)大約1 mm 左右的肋下緣作為進(jìn)針點(diǎn),先將針頭垂直于胸壁的方向持針,然后進(jìn)針方向各向下、向左(以小鼠的體位作為參照方向)傾斜大約15°角后進(jìn)行穿刺,穿刺深度大約10 mm,可事先用馬克筆在針頭上做好標(biāo)記。穿過右心室壁時(shí)可有明顯的突破感。 針頭成功進(jìn)入右心室后,可見針管中有回血,隨著心臟的搏動(dòng)有節(jié)律的回吸,同時(shí)持針的右手可明顯感受到心室有力的搏動(dòng)(圖1-10)。 松開擠壓小鼠胸壁的左手,右手固定穿刺針,在Lab Chart 軟件界面可以看到右心室搏動(dòng)的壓力曲線趨于穩(wěn)定,記錄一段穩(wěn)定的右心室壓力波形后拔出針頭。

(8)開胸驗(yàn)證穿刺點(diǎn)位置:迅速從劍突下向兩側(cè)剪開胸廓下的肌肉和組織,剪破膈肌,沿胸骨正中線剪開胸骨,將游離的兩側(cè)胸壁向兩側(cè)拉開,鑷子剝開心包膜,暴露心臟,用棉球擦去表面積血,仔細(xì)觀察可在右心室壁表面看到一個(gè)正在滲血的穿刺點(diǎn)(圖1-11、圖1-12),驗(yàn)證了步驟(7)的針頭成功刺入右心室,得到的波形圖為右心室壓力變化曲線。

(9)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄及數(shù)據(jù)分析:Lab Chart 軟件上記錄整個(gè)過程壓力的變化。 選擇一段平穩(wěn)的波型(如圖2、圖3),鼠標(biāo)右鍵選中該段波形,點(diǎn)擊添加到數(shù)據(jù)板,在數(shù)據(jù)板中則可查看該段波形的平均右心室收縮壓。

1.3.3 右心室肥厚指數(shù)的測(cè)定

分離小鼠心臟,剪去心耳和大血管,生理鹽水洗去心腔內(nèi)殘血,再沿室間隔剪下右心室,用濾紙吸去其水分,用電子天平分別稱量右心室(RV)、左心室+室間隔(LV+S)的質(zhì)量,最后計(jì)算右心室肥厚指數(shù)[RVHI=RV/(LV + S)× 100%],作為右室肥大的指標(biāo)。

1.3.4 肺組織的處理

摘下兩肺,分離出左肺,用0.9%的氯化鈉注射液沖洗干凈,固定于4% (體積分?jǐn)?shù)) 多聚甲醛溶液中24 h,然后依次進(jìn)行梯度乙醇脫水,石蠟包埋,做4 μm /張的連續(xù)切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE 染色)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組化染色(a-SMA 染色),最后在光鏡下(200 ×)觀察比較肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)來表示,兩組數(shù)據(jù)采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 實(shí)驗(yàn)操作步驟圖Figure 1 Experimental procedure diagram

圖2 正常小鼠的右室壓力曲線圖Figure 2 The RVSP curve of normal mouse

圖3 肺動(dòng)脈高壓小鼠的右室壓力曲線圖Figure 3 The RVSP curve of pulmonary hypertension mouse

2 結(jié)果

2.1 造模4 周后小鼠的一般情況

低氧組小鼠較對(duì)照組活動(dòng)量明顯減少,呼吸急促,毛發(fā)無光澤,口唇發(fā)紫,進(jìn)食飲水量也明顯減少,胸壁肌肉發(fā)紅發(fā)紫。 與對(duì)照組相比,低氧組小鼠體重明 顯 降低,[(18.24 ± 2.36) 比(22.62 ±2.87)],差異有顯著性(P＜0.05),結(jié)果見表1。

2.2 右室壓力曲線

從小鼠固定到測(cè)出右心室壓力曲線,整個(gè)過程可在3～4 min 內(nèi)完成,低氧組11 只小鼠的RVSP 全部測(cè)出,對(duì)照組12 只小鼠中,有1 只測(cè)定失敗,穿刺成功率達(dá)95.65%(22/23)。 在推擠胸廓固定心臟穿刺成功的幾秒內(nèi),壓力峰值較高且波動(dòng)較大,術(shù)者松手后,峰值略有下降并逐漸平穩(wěn),選取該段平穩(wěn)的壓力曲線得到RVSP 值(圖2、圖3):穩(wěn)定后的壓力波形為規(guī)則的單峰鋸齒狀,隨著呼吸節(jié)律的變化有輕微的波動(dòng),低氧組小鼠的RVSP 明顯高于對(duì)照組[(30.48±2.95) mmHg 比(17.50±3.40) mmHg],差異有顯著性(P＜0.05),結(jié)果見表1、圖4a。

2.3 右室肥厚指數(shù)及肺小動(dòng)脈病理改變

低氧組小鼠RVHI 也顯著高于對(duì)照組[(35.31±3.78)%比(23.14±4.29)%],差異有顯著性(P＜0.05),結(jié)果見表1、圖4b。 HE 染色顯示低氧組小鼠肺小動(dòng)脈管壁明顯比對(duì)照組增厚,a-SMA 免疫組化染色顯示管壁增厚部分為平滑肌細(xì)胞,說明低氧組小鼠組織學(xué)水平也呈現(xiàn)出肺動(dòng)脈高壓的病理變化,肺小動(dòng)脈重構(gòu)(圖5)。

表1 小鼠體重、RVSP、RVHI 的比較( ˉx ±s)Table 1 Body weight, right ventricular systolic pressure, and the index of right ventricular hypertrophy of the two groups

圖4 對(duì)照組和低氧組右心室收縮壓和肥厚指數(shù)的比較Figure 4 Comparison of RVSP and RVHI between the control group and the hypoxic group

圖5 肺小動(dòng)脈的病理改變(× 200)Figure 5 Pathological changes of pulmonary arteriole

3 討論

隨著基因工程小鼠制備技術(shù)的發(fā)展和成熟,加之小鼠品系繁殖力強(qiáng),繁殖周期短,飼養(yǎng)成本較低,基因背景較清楚[15],因此小鼠模型在肺血管疾病研究中的應(yīng)用越來越多,右心室壓力測(cè)定是評(píng)估小鼠血流動(dòng)力學(xué)的一種重要手段,有研究指出,右室流出道無狹窄及肺動(dòng)脈瓣無病變時(shí),肺動(dòng)脈收縮壓與右心室收縮壓基本一致,通過測(cè)量右室收縮壓可間接反映肺動(dòng)脈收縮壓[5,13]。 探求一種簡(jiǎn)便快捷并易于普及的小鼠右心室血流動(dòng)力學(xué)的測(cè)定方法有著非常重要的意義。

目前國內(nèi)測(cè)定大鼠和小鼠右室及肺動(dòng)脈壓力方法主要有經(jīng)頸外靜脈V 形切口右心導(dǎo)管法,經(jīng)導(dǎo)絲引導(dǎo)的右心導(dǎo)管法、開胸直視下穿刺右心室法或開腹經(jīng)膈肌穿刺右心室法,其中報(bào)道最多的是右心導(dǎo)管法,由于是盲插,普遍面臨著導(dǎo)管在靜脈交匯處無法順利通過、誤入下腔靜脈、在右心房或右心室內(nèi)打卷,刺破壁薄的靜脈引起胸腔內(nèi)出血、導(dǎo)管前段刺激右心室引起心律失常等,導(dǎo)致檢測(cè)指標(biāo)不準(zhǔn)確或失敗[5,7-9,11]。 而對(duì)于導(dǎo)絲引導(dǎo)下的穿刺法雖然一定程度上減少了導(dǎo)管直接操作的盲目性,但需要X 線定位,增加實(shí)驗(yàn)者放射線暴露[7]。 另外對(duì)于導(dǎo)管的選擇,要么價(jià)格昂貴(Millar 導(dǎo)管,3.5 萬人民幣),要么自制過程復(fù)雜(PE 導(dǎo)管)且易損耗[12],不利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。 開胸直視下穿刺右心室法需氣管插管和呼吸機(jī)通氣輔助,操作較為繁瑣,而且人為打開胸腔可能會(huì)影響心臟外周壓力,同樣開腹經(jīng)膈肌穿刺也有著同樣的缺點(diǎn),使得檢測(cè)指標(biāo)不能反映正常心臟解剖條件下的血流動(dòng)力學(xué)。 小鼠體型小、體重輕、血管壁薄及心臟體積小,進(jìn)行上述操作問題更加突出,右心室血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定一直是肺動(dòng)脈高壓小鼠模型評(píng)估中的一大難題,本實(shí)驗(yàn)采用的經(jīng)肋間肌穿刺法測(cè)定小鼠右心室壓力的實(shí)驗(yàn)方法,較好地解決了這些難題。

實(shí)驗(yàn)中通過分離小鼠胸部皮膚和淺層肌肉暴露肋間隙,觀察心臟的輪廓并判斷右心室的位置,從而進(jìn)行準(zhǔn)確的穿刺,由于操作簡(jiǎn)便快捷和無需進(jìn)行插管和呼吸機(jī)輔助通氣,大大縮短了測(cè)定壓力曲線所需要的時(shí)間,從胸部消毒開始到測(cè)出壓力平均需要3～4 min,同時(shí)也因胸腔密閉,減少了開胸對(duì)肺循環(huán)心臟血流動(dòng)力學(xué)的影響,因而操作簡(jiǎn)便快捷,結(jié)果真實(shí)可靠。 另外,使用材料主要有一次性輸液器針頭和手術(shù)器械及自制固定板,來源方便,能夠重復(fù)利用,不需要自行制備右心PE 導(dǎo)管,成本低廉。

操作步驟和技巧是取得實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。 我們總結(jié)出以下幾點(diǎn)操作細(xì)節(jié):①要鈍性分離胸大肌、胸小肌以暴露肋間隙,避免損傷肋間肌及胸膜引起氣胸;②透過肋間隙觀察心臟時(shí),左手手指一定要輕輕推擠胸壁,使心臟緊貼左胸前壁固定,這樣才能準(zhǔn)確判斷右心室的位置;③穿刺時(shí)一定要掌握好進(jìn)針角度和深度,進(jìn)針角度為持針手偏向小鼠頭側(cè)和左側(cè)各15°左右,深10 mm 左右,事先做好標(biāo)記,應(yīng)注意一次性進(jìn)針,進(jìn)針后若波形未立即出現(xiàn),可能是針尖口剛好貼著心肌壁,可輕微調(diào)整進(jìn)針深度。 右心室穿刺成功后測(cè)壓應(yīng)選取動(dòng)物胸腔不受擠壓、RVSP 曲線穩(wěn)定的那一部分作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);④保證整個(gè)測(cè)壓系統(tǒng)密閉性和通暢性,管內(nèi)不能留有氣泡,以免影響壓力傳導(dǎo),每完成一次操作,要及時(shí)地推注注射器內(nèi)的肝素生理鹽水,防止針頭內(nèi)出現(xiàn)血凝塊,針頭變鈍時(shí)應(yīng)及時(shí)更換。

本實(shí)驗(yàn)中的肺動(dòng)脈高壓小鼠模型為持續(xù)性低氧誘發(fā),慢性缺氧引發(fā)肺動(dòng)脈高壓的特征性變化是肺血管發(fā)生重塑,肺血管細(xì)胞尤其是平滑肌細(xì)胞發(fā)生慢性增殖,各級(jí)肺血管管壁明顯增厚,肺循環(huán)外周阻力增加,肺動(dòng)脈壓進(jìn)行性升高,最終導(dǎo)致右心室增大,發(fā)展為右心衰竭[9]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低氧組動(dòng)物RVSP 和RVHI 顯著升高,病理示低氧組小鼠肺小動(dòng)脈管壁明顯較對(duì)照組增厚和平滑肌細(xì)胞增殖,與國內(nèi)外其它實(shí)驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)相近[12-13]。 綜上所述,本文詳細(xì)介紹了一種經(jīng)肋間肌穿刺法測(cè)定肺動(dòng)脈高壓小鼠模型右心室壓力的實(shí)驗(yàn)方法,保持動(dòng)物胸腔密閉無需呼吸機(jī)輔助,且操作簡(jiǎn)單、方便快捷、成功率高,值得推廣應(yīng)用。